长白山野菊花类黄酮微波法提取工艺研究

2013-09-05王立江蒋玥

食品研究与开发 2013年7期

王立江，蒋玥

（吉林农业科技学院，吉林吉林 132101）

长白山野菊花（Chrysanthemum indicum L.flowers），是生长于长白山地带的一种天然菊科植物，有药用作用的部分是其干燥的头状花序[1]，又名为“疟疾草”、“山菊花”、“苦薏”等。野菊花在我国民间药用历史悠久，始载于唐《本草拾遗》；《名医别录》中记载其“苦、辛、微寒”，具有“清热解毒、平肝”具有清热解毒、平肝的功效[2]。现代研究得到野菊花具有广谱抗菌[3]、抗病毒的功效，还有消炎[4]、抗癌的功效；野菊花中富含黄酮类化合物、萜类、挥发油[5]、多种有机酸（包括：绿原酸、棕榈酸等）。野菊花尚含有山蓊酸甘油酯，还有叶绿素、维生素及硒、镍、锰等多种微量元素和胆碱、水苏碱、嘌呤、鞣质等。临床上利用野菊花治疗慢性盆腔炎，宫颈糜烂，慢性前列腺炎均有显著功效。野菊花中类黄酮是野菊花各种药理作用的主要成分。类黄酮可以抑制脂质氧化[6]，血小板凝集从而降血压、清除活性氧自由基[7]；其舒张血管的作用可以增加冠脉血流量，改善毛细管的通透性及脆性。目前临床还会用于治疗病毒性肝炎、前列腺炎、慢性咽炎等各种炎症及病毒性疾病、心血管疾病、高血压、传染性软疣及癌症。

微波提取法是利用微波能来提高提取速率的一种最新发展起来的技术，具有快速、节能、得率高的优点[8]。微波提取法在我国的中药检测、环境保护测定、天然香精香料开发、食品分析、化妆品[9]等领域日益受到重视。1992年陆续在美国、墨西哥、日本、西欧、韩国被广泛应用，在薄荷、海藻中提取有效物质均获得成功。目前微波提取技术主要有三种：直接采用家电型微波炉对原材料处理进行试验；自制的具有压力和温度控制的微波提取设备；专门制造的微波提取系统[10]。

微波提取技术的特点：微波加热属于“体积加热”，加热迅速且加热均匀性好，热量直接作用于介质分子，使物料整体同时被加热。选择性加热[11]，可提高提取效率以达到更好的提取效果，节省原料的消耗。热量损失少，效率高，高效节能并且易于控制。整个过程不产生余热和粉尘、无有害气体排放，安全环保[12]。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

长白山野菊花：采摘于长白山脉；AL204型电子天平：上海速展计量仪器有限公司；g80f23cn2l-a9（so）格兰仕微波炉：广东格兰仕集团有限公司；JH-210K宇普食品加工机：慈溪鸣威电子商务有限公司；TDL-4型台式离心机：上海嘉鹏科技有限公司；UV-1700型紫外可见光分光光度计：上海将来实验设备有限公司；移液器：市售。

1.2 方法

1.2.1 提取工艺

将长白山野菊花风干至恒重后，用食品加工机研磨成细分，采用AL204型电子天平称取1 g粉末装于250 mL的锥形瓶中备用。将锥形瓶中加入定量的蒸馏水后[13]，在微波炉中加热一定时间后，取出加入一定量的乙醇，采用回流提取，提取温度为70℃、时间2 h。将提取液用滤纸过滤后，取适量提取液采用TDL-4型台式离心机将提取液离心后待测定。

1.2.2 类黄酮含量测定

取离心后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至25 mL后，静置2 min，加入到洗净擦干的比色皿中，用UV-1700型紫外可见光分光光度计，采用波长为360 nm的紫外光，测定提取液的吸光度。根据芦丁标准曲线可以直接得到类黄酮浓度，再根据定容的体积可求得类黄酮含量。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Standard curve of the rutin standard samples

1.2.3 单因素试验

在提取过程中选取微波处理强度、微波处理时间、提取液浓度及料液比4个可能影响类黄酮提取效果的因素分别做单因素试验。将提取液以“1.2.2”方法测定吸光值，以图1标准曲线求得类黄酮得率，以其为考察指标，确定选取各因素的合适范围。

1.2.3.1 以微波强度为研究因素

称取1 g长白山野菊花粉末，装于250 mL的锥形瓶中，以 1∶20（g∶mL）的料液比加入蒸馏水，分别选取0、300、600、900、1 200 W 5 组不同的微波处理强度，将野菊花料液处理4 min，加入浓度为70%乙醇20 mL，以提取温度为70℃、时间2 h进行回流提取。取离心分离后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至25 mL，静置2 min，用UV-1700型紫外可见光分光光度计，采用波长为360 nm的紫外光，测定提取液的吸光度。根据芦丁标准曲线可以直接得到类黄酮浓度，再根据定容的体积可求得类黄酮含量。

1.2.3.2 以微波处理时间为研究因素

称取1 g长白山野菊花粉末，装于250 mL的锥形瓶中，以 1 ∶20（g∶mL）的料液比加入蒸馏水，在 600 W的微波强度下，分别处理 2、3、4、5、6 min 后，加入浓度为70%的乙醇20 mL，提取温度为70℃、时间2 h进行回流提取。取离心分离后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至25 mL，静置2 min，用UV-1700型紫外可见光分光光度计，采用波长为360nm的紫外光，测定提取液的吸光度。根据芦丁标准曲线可以直接得到类黄酮浓度，再根据定容的体积可求得类黄酮含量。

Let Eqs. (6) – (5), finally we get the output resistance:

1.2.3.3 以提取液浓度为研究因素

称取1 g长白山野菊花粉末，装于250 mL的锥形瓶中，以 1 ∶20（g∶mL）的料液比加入蒸馏水，在 600 W的微波强度下处理4 min，分别加入20 mL浓度为50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在70℃下回流提取2 h。取离心分离后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至25 mL，静置2 min，用UV-1700型紫外可见光分光光度计，采用波长为360nm的紫外光，测定提取液的吸光度。根据芦丁标准曲线可以直接得到类黄酮浓度，再根据定容的体积可求得类黄酮含量。

1.2.3.4 以提取液料液比为研究因素

称取1 g长白山野菊花粉末，装于250 mL的锥形瓶中，加入料液比分别为 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30[14]的蒸馏水（g∶mL），在 600 W 的微波强度下将野菊花料液处理4min，加入浓度为70%的乙醇20mL，在70℃下回流提取2 h。取离心分离后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析纯）定容至25 mL，静置2 min，用UV-1700型紫外可见光分光光度计，采用波长为360 nm的紫外光，测定提取液的吸光度。根据芦丁标准曲线可以直接得到类黄酮浓度，再根据定容的体积可求得类黄酮含量。

2 结果与分析

2.1 最佳微波强度的确定

准确称取1g长白山野菊花粉末，以1∶20（g∶mL）的料液比加入蒸馏水，分别选取0、300、600、900、1200W 5组不同的微波处理强度，将野菊花料液处理4 min，取出后加入浓度为70%的乙醇20 mL，在70℃下回流提取2 h后，滤液采用1.2.2的方法测得类黄酮的含量，得到图2，即为不同微波强度处理后的结果：

图2 微波处理强度对类黄酮得率的影响Fig.2 Influence of micro-wave treatment power on flavonoid extraction yield

从图2可以看出，提取液中类黄酮的含量在一定范围内会随着微波强度的增加而上升。当微波强度由0上升到600 W时，得率逐渐上升；达到600 W时，提取类黄酮含量最高。随后随着微波强度的上升，类黄酮得率开始下降。可能由于微波处理技术是将微波电磁能转化成热能，利用微波受热均匀的特点，辅助提取，从而提高类黄酮得率。但是当微波强度过高时，细胞受热温度升高过快、达到的温度过高且容易使溶液暴沸导致溶液溢出或者容器内溶液蒸干，都会影响类黄酮得率。从而使提取液中类黄酮含量下降。所以适宜的微波处理强度为600 W。

2.2 最佳微波处理时间的确定

准确称取1 g长白山野菊花粉末，以1∶20（g∶mL）的料液比加入蒸馏水，将料液在600 W的微波强度下，分别选取 2、3、4、5、6 min 5个水平的处理时间处理，取出后加入浓度为70%的乙醇20 mL，在70℃下回流提取2 h后，滤液采用1.2.2的方法测得类黄酮的含量，得到图3，即为不同微波处理时间对类黄酮得率的影响结果。

从图3可以看出，微波处理时间对长白山野菊花中类黄酮的得率的影响也至关重要，微波处理的穿透力强，在短时间内便可以让料液中的极性分子吸收大量的热量，使类黄酮得率在短时间内提高。在操作中微波处理时间过短，达不到微波处理的目的，提高得率的效果不明显；当时间达到4 min时达到最高点。采用更长时间处理野菊花，由于长时间的微波作用，微波的强热效应使野菊花加热过度，组织中的类黄酮被破坏分解，同时蛋白质发生变性，阻挡类黄酮的溶出以及加热时间过长，水分过分蒸发，导致类黄酮溶出减少，反而使类黄酮得率开始缓慢下降，所以适宜的微波处理时间为4 min。

图3 微波处理时间对类黄酮得率的影响Fig.3 Influence of micro-wave treatment temperature on flavonoid extraction yield

2.3 最佳提取液（乙醇）浓度的确定

准确称取1 g长白山野菊花粉末，以1∶20（g∶mL）的料液比加入蒸馏水，将料液在600 W的微波强度下处理4 min，取出后分别选取乙醇浓度为50%、60%、70%、80%、90%体积分数为测量标准，分别取20 mL加入，在70℃下回流提取2 h后，滤液采用1.2.2的方法测得类黄酮的含量，得到图4，即为不同提取液（乙醇）浓度对类黄酮得率的影响结果：

图4 乙醇浓度对类黄酮得率的影响Fig.4 Influence of ethanol concentration on flavonoid extraction yield

从图4可以看出提取液乙醇的浓度对类黄酮得率影响较大，在体积分数小于70%的浓度标准时，类黄酮得率随着乙醇浓度上升，当浓度大于70%的浓度标准后，再提高乙醇溶液的浓度，类黄酮得率急剧下降。在提取类黄酮的过程中，乙醇作为一种提取剂，将类黄酮溶入。当乙醇浓度较小时，溶出的糖类、水溶性蛋白质等因提取液含水量较多而溶出较多，类黄酮得率较少，当浓度达到70%的浓度标准时类黄酮得率达到最高；但随着乙醇浓度的升高，酒精浓度过高会使叶绿素等物质溶出，影响类黄酮的溶出而使得率下降，所以适宜的乙醇浓度为70%的浓度标准。

2.4 最佳料液比的确定

准确称取1 g长白山野菊花粉末，分别以1∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g∶mL）的料液比加入蒸馏水单位，将料液在600 W的微波强度下处理4 min，取出后加入浓度为70%的乙醇20mL，在70℃下回流提取2 h后，滤液采用1.2.2的方法测得类黄酮的含量，得到图5，即为不同提料液比对类黄酮得率的影响结果。

图5 料液比对类黄酮得率的影响Fig.5 Influence of ratio of solid to liquid on flavonoid extraction yield

从图5可以看出，类黄酮的得率随着料液比的增加先上升后下降。料液比越大，溶质与溶剂之间两项浓度差较大，有利于类黄酮向溶剂中扩散，所以溶剂量越大越有利于类黄酮的溶出，同时料液较少时，在微波处理的过程中，水分蒸发容易导致料液干涸，阻碍类黄酮的溶出；但是当料液比大于1∶20（g∶mL）时，溶剂量过大，不利于已溶出的类黄酮对未浸出黄铜的协同浸提作用，从而在料液比大于1∶20（g∶mL）时，使类黄酮得率下降。所以最适宜的料液比为1∶20（g∶mL）。

2.5 正交试验结果

为了确定提取长白山野菊花中类黄酮的最佳提取工艺条件，及各因素对类黄酮提取的影响大小，在以上单因素试验的基础上，选取微波处理强度、微波处理时间、提取液浓度及料液比4个可能影响类黄酮提取效果的因素，进行4因素3水平的正交试验，正交试验结果，如表1。

表1 正交设计表Table1 Design of orthogonal test

从表2分析，在正交实验中利用同一水平试验之和K求得各水平试验的平均值k。根据k计算因素列的极差R，R表示该因素在其取值范围内试验指标的变化幅度。

表2 极差分析表Table 2 Result of orthogonal test

R=kimax-kimin

根据每个因素的极差R，说明各因素对类黄酮的得率都有一定的影响。根据极差R的大小分析，各因素对长白山野菊花中类黄酮得率影响相关性排列为：微波处理强度＞料液比＞微波处理时间＞提取液（乙醇）浓度，说明在微波法提取长白山野菊花的试验中微波处理强度对类黄酮的得率影响最大，料液比对类黄酮得率的影响其次，接下来影响长白山野菊花中类黄酮提取得率的是微波处理时间，对类黄酮得率影响最小的就是乙醇的浓度。

根据各试点以外的试验组合的平均得率分析，各因素的优先水平为：A1、B3、C2、D2，所以长白山野菊花中类黄酮提取工艺条件最佳组合为A1B3C2D2，即微波处理时间为 3 min、料液比为 1∶25（g∶mL）、提取液（乙醇）浓度为70%、微波处理强度为600 W。

3 验证试验

根据前面的正交试验结果可知，各因素对长白山野菊花中类黄酮得率影响相关性排列为：微波处理强度＞料液比＞微波处理时间＞提取液（乙醇）浓度。通过正交试验确定最佳提取工艺条件为：即微波处理时间为 3 min、料液比为 1∶2（g∶mL）5、提取液（乙醇）浓度为70%、微波处理强度为600 W；不在试验组内，因此在此条件下进行3次重复试验，类黄酮得率分别为：60.31 mg/g、59.84 mg/g、60.19 mg/g，平均值为 60.11 mg/g，根据3次重复试验得到的类黄酮得率高于正交实验及单因素试验的每组结果。所以长白山野菊花中类黄酮提取工艺条件最佳组合为A1B3C2D2，即微波处理时间为 3 min、料液比为 1∶25（g∶mL）、提取液（乙醇）浓度为70%、微波处理强度为600 W。

4 结论

微波提取工艺是一种新型提取工艺技术，可以有效的节省时间，降低成本；长白山野菊花使药用性很高且来源普遍的植物。本实验采用普通微波炉处理，以水为溶剂进行野菊花中类黄酮的提取后又利用传统索氏提取处理料液，大幅度的提高了野菊花中类黄酮的得率。根据试验结果表明，长白山野菊花中类黄酮提取的最佳微波提取工艺条件为：微波处理时间为3 min、野菊花粉末与提取液比为 1 ∶25（g∶mL）、提取液乙醇的浓度为70%、微波处理强度为600 W。

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