热变性法提取鸭血SOD的响应面优化

周亚迪，李诚，叶瑞雪

（四川农业大学食品学院，四川雅安 625014）

热变性法提取鸭血SOD的响应面优化

周亚迪，李诚*，叶瑞雪

（四川农业大学食品学院，四川雅安 625014）

摘 要：以新鲜鸭血为原料，研究鸭血超氧化物歧化酶（SOD）在热变性环境下的提取工艺。通过单因素试验确定了热变性温度、热变性时间、硫酸锌浓度3个因素的取值范围，并根据中心组合设计原理及响应面分析得出最优提取条件。结果表明：热变性温度55.3℃，热变性时间12 min，硫酸锌的质量浓度3.9%，硫酸铜的质量浓度1%，SOD比活为1 224.37 U/mg。

关键词：鸭血；超氧化物歧化酶；热变性；响应面法

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是人体内清除超氧阴离子自由基的有效物质，因其具有抗氧化、抗衰老、增强免疫力等保健效果，现已广泛运用到生物化学、酶学、生物学、分子生物学和医学等诸多学科[1-3]。国内外有不少单位将SOD作为天然抗氧化剂加到面包、糕点、方便面及罐头食品中，作为防腐剂收到了很好的效果。并有实验证明，SOD能够口服吸收，并能在体内保持良好的活性，因此SOD在食品行业的运用具有良好的开发前景。

SOD的主要来源是动物血和肝脏，动物血中SOD不仅含量丰富，且提取方便成本低，红细胞膜易破[4]，我国每年来自畜禽的血源有2 300万t，而很久以来我国对血液有足够的认识，但没有充分的利用[5]。一方面给予血液很高的评价，认为血液具有较高的营养保健作用，是一种很好的蛋白质资源[6]。而另一方面，由于受诸多因素的限制，目前利用率不到1%[7]，致使大量宝贵的畜禽血液资源浪费，并造成环境污染。目前对猪血、羊血、牛血等畜血中SOD有部分研究[8-10]，提取工艺也相对较成熟，而对于禽血研究相对较少。2009年我国鸭的存栏量、出栏量均居世界首位[11]。因此，充分利用鸭血生产SOD大有发展潜力。

目前提取SOD的主要方法有盐析法、溶胀法、有机溶剂法、酶法等，工艺较复杂，所用溶剂易污染环境，且成本较高。而热变性法是利用血细胞中SOD和血红蛋白的变性温度不同来分离除去杂蛋白，达到提取出SOD的目的。该方法操作简便，成本低廉，环保，但是同样存在很多不足[12-13]。有研究表明，在热变性法提取SOD工艺中，硫酸盐比氯盐对SOD的保护效应好，铜锌盐互配比单一的铜盐或锌盐对SOD的保护效应好[14]。本实验以热变性法为基础，重点研究SOD在提取过程中各影响因素（铜锌盐互配浓度、热变性温度、热变性时间）对SOD活性的影响，并利用响应面分析的方法来求出最佳工艺条件，为制备高活性的SOD提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸭血采自四川省雅安市创业商城市场；柠檬酸三钠、氯化钠、硫酸锌、硫酸铜等均为分析纯，考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白。

1.2 仪器与设备

BR4i型多功能冷冻离心机：美国THERMO公司；Mill-Q型超纯水系统：美国Millipore公司；Scientz-ⅡD型超声波细胞粉碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；UV-3200扫描型紫外可见分光光度计、V-1200型可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；BT 12S电子天平、pHS-3C精密pH计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；HH-4数显恒温水浴锅：金坛市富华仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶血液的制备

新鲜鸭血以3.8%柠檬酸三钠抗凝，4℃条件下5 000 r/min离心15 min除去黄色血浆，收集红血球，4℃条件下用生理盐水洗涤红血球，5 000 r/min离心10 min，洗涤3次，量取血球体积，加入等体积超纯水得到溶血液，0℃～4℃条件下用超声波细胞粉碎仪破碎血细胞（200 W/10 min），4℃冰箱保存备用。

1.3.2 热变性提取工艺单因素实验

以新鲜鸭血为原料，考察提取SOD的工艺参数，重点考察热变性温度，热变性时间，硫酸盐浓度对SOD活性的影响。

1.3.3 提取工艺条件的响应面分析

在单因素试验基础上，确定Box-Behnken设计的自变量，以SOD比活力为响应值，利用Design-Expert7.1.6软件进行响应曲面分析优化提取条件。

1.3.4 SOD活性的测定

邻苯三酚自氧化速率测定法[15]。

1.3.5 样品中蛋白质含量的测定

考马斯亮蓝比色法[16]。

2 结果与分析

2.1 蛋白质标准曲线的建立

标准曲线的绘制：用蛋白质标准液配成不同浓度的蛋白质溶液，在595 nm波长下比色测定光吸收值，以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制出标准曲线为y=0.005 1x+0.0013，R2=0.996 8。

2.2 单因素试验结果分析

2.2.1 热变性温度对酶活性的影响

选取 45、50、55、60、65 ℃ 5 个温度考察热变性温度对酶活性的影响，结果见图1。

图1 热变性温度对酶活性的影响Fig.1 The effect of heating denaturation temperature on activity of SOD

由图1可知，鸭血中SOD的酶比活在热变性温度45℃～60℃呈缓慢上升趋势，65℃时较60℃时的酶比活稍低，65℃～70℃时的酶比活完全呈急剧下降趋势，说明高于65℃的热变性温度对SOD的活性有直接负面的影响，因此最佳热变性温度范围选择为55℃～65℃，最佳热变性温度是60℃。

2.2.2 热变性时间对酶活性的影响

选取 10、15、20、25、30 min 5 个时间考察热变性时间对酶活性的影响，结果见图2。

图2 热变性时间对酶活性的影响Fig.2 The effect of heating denaturation time on activity of SOD

由图2可知，随着加热时间的延长，SOD活性处于上升趋势，热变性时间在15 min时，鸭血中SOD的活性达到最高，之后呈下降趋势，在热变性温度在20 min以后，酶活性趋于稳定，说明热变性时间在20 min以后，对SOD活性的影响较小，因此热变性的最佳时间范围是10 min～20 min，最佳热变性时间是15 min。

2.2.3 硫酸锌浓度对酶活性的影响

在前期的预实验中，发现硫酸铜浓度一定时，硫酸锌的质量浓度在1%时，鸭血中SOD的酶比活达到最高值，随着硫酸锌的浓度逐渐升高，SOD的活性反而降低，说明低浓度的硫酸锌对SOD具有保护作用。因此，本实验选择在质量浓度为1%硫酸锌浓度下，硫酸铜浓度在1%～8%变化范围内对酶活性的影响，结果如图3所示。

图3 不同硫酸锌质量浓度对酶活性的影响Fig.3 The effect of concentration of zinc sulfate quality on activity of SOD

由图3可知，硫酸锌浓度在1%时，随着硫酸铜的质量浓度逐渐增加，鸭血中SOD的活性在逐渐升高，在4%时达到最大值，随后急剧下降，SOD的活性在硫酸铜浓度在5%～8%的范围时趋于平稳状态，说明，硫酸铜的浓度增加到5%后对SOD的活性影响减小，因此最佳提取鸭血中SOD硫酸铜浓度为4%。

2.3 提取工艺条件的响应面优化分析

2.3.1 响应面法试验设计及结果

综合单因素试验结果，根据中心组合试验设计原理，以热变性温度，热变性时间，硫酸铜浓度为自变量，分别由A、B、C表示，以酶比活为响应值，进行试验设计，利用Design-Expert7.1.6数据分析软件优化提取条件。试验因素水平编码见表1，试验方案及结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface analysis

2.3.2 回归模型建立及方差分析

回归模型建立及方差分析见表3。

经Design-expert7.6软件对试验结果进行回归分析，建立响应面回归模型，得到以酶比活为目标函数的回归方程：

表2 响应面优化试验Box-Benhnken设计及结果Table 2 Box-Behnken design arrangement and experimental results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

从表3可以看出，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著，模型的显著水平远远小于0.05，因此酶比活回归方程（模型）的回归效果极显著，其中，C、A2、B2、C2对结果影响显著。此时从回归方程各项的方差分析结果（回归系数R2=0.924 7＞0.9）还可以看出方程的失拟项较小，说明该回归方程对实际实验拟合情况较好，各自变量和响应值之间线性关系显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对SOD活性影响的大小依次为热变性时间＞硫酸锌浓度＞热变性温度。

图4 各因素交互作用等高线和响应面图Fig.4 Response surfaces of the pairwise interactive effects of four extraction conditions on extraction rate of proanthocyanidins from betel nut

2.3.3 响应面曲面分析

在本实验中，每一个响应面对其中两个因素进行分析，另外一个因素被固定在零水平[17]，利用Design-Expert7.1.6软件对数据进行二次多元回归拟合[18]，各因素之间的交互作用见图4。

图4直观地反映了各因素对酶活性的影响。等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，圆形表示两交互作用不显著，椭圆形表示两交互作用显著[19]，从三维响应面图可以看出每个响应面都具有各自的较优区域[20]。比较图4中的等高线图，各等高线都呈现椭圆状态，且硫酸锌浓度与热变性温度的交互作用相对较显著。各响应面图中，热变性时间对酶活性的影响较显著，表现为曲线较陡。

由Design-Expert7.1.6软件分析得到的最大响应值时对应的编码值分别为A=-0.108，B=0.057，C=-0.397，与之相应的热变法提取鸭血SOD工艺最佳条件为硫酸锌浓度3.89%、热变性温度55.28℃、热变性时间11.98 min，理论最佳提取条件下的酶比活为1 243.25 U/mg。

2.3.4 验证试验

为了验证此方法的可靠性，采用所得到的最佳提取工艺条件进行验证实验，考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为硫酸锌浓度3.9%，硫酸铜浓度1%、热变性温度55.3℃、热变性时间12 min条件下，验证试验结果，重复试验3次，结果取平均值，酶比活为1 224.37 U/mg。可知预测结果与实际情况拟合较好。

3 结论

本实验在单因素试验的基础上，通过响应面分析确定了热变性法提取鸭血中SOD的最佳工艺条件，即硫酸锌浓度3.9%，硫酸铜浓度1%、热变性温度55.3℃、热变性时间12 min，SOD活性达1 224.37 U/mg。各因素对SOD活性影响的大小排序为：热变性时间＞硫酸锌浓度＞热变性温度。本实验为鸭血中SOD的热变性法提取工艺进行改进，与传统提取工艺相比提高了SOD活性[21]，为进一步保持高活性分离纯化鸭血SOD提供了科学参考。

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Optimizing Heating Denaturation Extraction of SOD from Duck Blood by Response Surface Methodology

ZHOU Ya-di，LI Cheng*，YE Rui-xue
（College of Food Science ，Sichuan Agricultural University，Ya'an 625014，Sichuan，China）

Abstract：With fresh duck blood as raw materials，study of superoxide dismutase （SOD） from duck blood in thermal denaturation conditions extraction process.hrough single factor experiment to determine the thermal denaturation temperature，heating time，the zinc sulfate concentration by a factor of three range，and according to a central composite design principle and response surface analysis the optimum extraction conditions.The results show that： the thermal denaturation temperature at 55.3 ℃， heating time 12 min，the concentration of 3.9%zinc sulfate，copper sulfate concentration of 1%，SOD specific activity of 1 224.37 U/mg.

Key words：duck blood；superoxide dismutase（SOD）；heating denaturation method；response surface method（RSM）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2013.13.005

2010年教育部国家级创新性实验（101062625）

周亚迪（1990—），女（汉），在读本科，研究方向：农产品贮藏及加工工程。

李诚（1964—），男，教授，硕士，研究方向：畜产品加工与质量安全控制。

2012-12-23