L-型钙通道电流在D型钠尿肽抑制豚鼠胃动力中的作用

郭 莉，李 萍，邱 阳，刘越坚，贺守城，法欣欣，郭慧淑

(大连医科大学附属第一医院，辽宁 大连 116011)

D型钠尿肽(DNP)是最近发现的钠尿肽家族新成员，是从一种美洲蛇的蛇毒中提炼出来的、由38个氨基酸组成的聚肽类物质［1］。到目前为止，关于DNP 的研究仅仅局限在心血管系统［2～4］、神经系统［5］和泌尿系统［6］，而在胃肠动力方面的研究较少。Kim等［7］首次在大鼠结肠内发现DNP并作为局部调质调节结肠动力。我们以往的研究发现，DNP能通过增加钙敏感的钾电流抑制胃窦环形肌自发性收缩活动［8］。在平滑肌上主要有两种向内的钙离子通道:一种是L-型，另一种是T-型。在胃窦环形肌上发现，毒蕈碱受体依赖的平滑肌收缩通过百日咳毒素敏感的GTP蛋白和L-型电压门控钙通道控制的细胞外钙离子实现［9］，在胃平滑肌上还未发现T-型钙离子通道［10］。L-型钙通道作为重要的离子通道在调节胃动力中起重要作用，到目前为止还没有关于L-型钙通道电流参与DNP抑制胃动力方面的报道。2012年1～10月，我们观察了L-型钙通道电流在DNP抑制豚鼠胃动力中的作用及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 EWG/B豚鼠40只，雌雄不拘，鼠龄不限，体质量(300±50)g，由大连医科大学SPF动物中心提供，许可证号:SCXK(辽)2008-0002。主要仪器:MP150多道生理记录仪(BIOPAC公司，美国)、Pcalmp700B膜片钳(AXON公司，美国)、Ⅸ-70倒置显微镜(Olympus，日本)。药品及溶液:乌拉坦(北京恒业中远化工有限公司)，DNP(Sigma公司，美国)，鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583、cGMP依赖的蛋白激酶G抑制剂KT5823、cGMP敏感的磷酸酯酶抑制剂 zaparinast(Sigma公司，美国)，台氏液(自配)。台氏液的成分(mmol/L):NaCl 147，KCl 4，NaH2PO40.42，Na2HPO41.81，MgCl21.05，Glucose 5.5，以 NaOH 调 pH 值至7.35;PSS的成分(mmol/L):NaCl 134.8，KCl 4.5，HEPES 10，CaCl22，MgCl21，Glucose 10，以 Tris调 pH 值至 7.40;无钙 PSS 的成分(mmol/L):NaCl 134.8，KCl 4.5，glucose 5，HEPES 10，MgCl2·6H2O 1，Glucose 10，以 Tris调pH值至7.40;改进 Kraft-Bruhe液(K-B液)的成分(mmol/L):EGTA 0.5，HEPES 10，MgCl2·6H2O 3，KCl 50，Glucose 10，L-Glutamate 50，Taurine 20，KH2PO420，以KOH调pH值至7.40;PSS(含Ba2+)的成分(mmol/L):NaCl 134.8，KCl 4.5，HEPES 10，BaCl210，MgCl2·6H2O 1，Glucose 10，以 Tris调 pH值至7.40;电极内液的成分(mmol/L):CsCl 110，TEA 20，EGTA 10，HEPES 5，Na2ATP 3，MgCl2·6H2O 3.5，以 Tris调 pH 值至7.30。配制完成后，用1 mL的分装瓶分装，存放于0℃的冷冻箱中，实验前解冻使用。

1.2 方法

1.2.1 肌条制作 将豚鼠用50 mg/kg乌拉坦麻醉后，沿中线剖腹取胃，置氧饱和台氏液中，去掉黏膜层，分离环行肌，剪成2.0 mm ×15.0 mm 肌条，置于容积2 mL的小槽内，槽盖上有一玻璃小钩，肌条的一端固定在玻璃小钩上，另一端连于张力换能器(TD-112S，El本)上，换能器与四道生理记录仪连接，记录肌条的收缩活动。小槽始终用氧饱和台氏液灌流，通过恒温装置使槽内温度保持(37.0±0.5)℃。肌肉基础状态记录一段时间后，给予1 nmol/L DNP，观察肌肉收缩反应，待洗脱稳定后再分别给予10、100 nmol/L DNP，继续观察肌肉收缩反应。

1.2.2 细胞制备及其电生理记录 剪取胃窦部放入氧饱和的、无钙的PSS缓冲液中漂洗，分离环行肌，剪成1 mm×4 mm肌条。将肌条放入4℃的KB液中保存15 min，置入含36℃消化液(由0.1%的Ⅱ型胶原酶、0.1%的二硫苏醇糖、0.15%的胰蛋白抑制剂和0.2%的牛血清白蛋白溶于4 mL无钙PSS缓冲液)的试管中孵育15 min，将消化好的肌条移至4℃ K-B液中保存，在实验前用管口圆滑的滴管轻轻吹打肌条即可得到分离的单细胞。取0.1 mL细胞悬浮液平铺于倒置显微镜镜台上的灌流槽底部，10～15 min后细胞沉降至槽底，用等渗溶液进行灌流(2～3 mL/min)。然后用电阻为2～5 MΩ的玻璃电极进行5～10 GΩ封接，Axopatc h1-D型膜片钳放大器记录L-型钙通道电流。

1.2.3 统计学方法 肌肉收缩幅度采用SPSS16.0统计，电流幅值采用Clamp Fit10统计，结果以表示，比较采用同体对照t检验和组间比较t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DNP对环形肌自发性收缩活动的影响 自发性收缩活动通常在肌条孵育40 min后出现，当给予1、10、100 nmol/L DNP，自发性收缩活动受到明显抑制，抑制程度分别为(35.00±7.00)%、(54.00±8.00)%、(78.00 ±13.00)%，具有明显的剂量依赖关系(r=0.923，P ＜0.05)。

2.2 DNP对环形肌细胞L-型钙通道电流的影响

2.2.1 钙电流的引导 在传统全细胞模式下，细胞外持续灌流含有2 mmol/L Ca2+的PSS，将膜电位钳制在+80 mV，每10 s给予10 mV的去极化阶跃刺激，使细胞膜电位从－40 mV去极化到+60 mV，持续时间为400 ms时，即可记录到钙电流(ICa)。ICa在膜电位去极化至－40 mV时开始出现，峰值在0 mV时出现，平均为( －124.02±56.34)pA，翻转电位在膜电位去极化至约 +45 mV时出现。用10 mmol/L的Ba2+代替细胞外灌流液中2 mmol/L的Ca2+，施加相同的阶跃刺激，即可引导出内向性钡电流(IBa)，与ICa相比幅度明显增加，IBa在细胞膜电位去极化至－40 mV时开始出现，当膜去极化至0 mV 时，IBa峰值为( －587.91±95.55)pA，翻转电位在去极化阶跃刺激约50 mV时出现。IBa的失活较ICa慢，在400 ms的刺激时间内并没有完全失活。L-型钙通道特异性阻断剂nicardipine(5 μmol/L)可以明显抑制IBa，并且I-V曲线形状及分布无明显改变。因此，用IBa代替ICa。

2.2.2 DNP对L-型钙通道电流的影响 当膜电位钳制在－80 mV，以10 s的时间间隔给予10 mV的去极化阶跃刺激，使细胞膜电位从－40 mV去极化至+60 mV，持续时间为400 ms时，即可记录到IBa。DNP对IBa具有明显的抑制作用，125 s后抑制效应趋于稳定，抑制率为(67.42±3.78)%，当把DNP洗脱后，IBa只是部分恢复。I-V曲线显示，在去极化刺激从－20～+40 mV区间DNP明显降低IBa。见图1。1、10、100 nmol/L的 DNP 抑制 IBa分别为(60.12 ±2.02)%、(57.12 ±3.02)%、(42.12±3.16)%。见图2。

2.2.3 DNP抑制钙电流与pGC-cGMP-PKG信号通路的关系 用鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583预处理后，10 nmol/L DNP对IBa的抑制作用由预处理前的(67.12 ±4.02)% 减弱为(88.03 ±4.15)%。用蛋白激酶G特异性抑制剂KT5823预处理后，10 nmol/L DNP几乎完全阻断了DNP引起的IBa抑制作用。而cGMP敏感的磷酸酯酶抑制剂zaparinast预处理后，10 nmol/L DNP对IBa的抑制作用由预处理前的 (67.12 ±4.02)% 增强至 (53.00 ±4.23)%。见图 3。

图1 10 nmol/L DNP对环形肌细胞IBa影响的I-V曲线

图2 不同浓度DNP对环形肌细胞IBa的影响

图3 DNP抑制IBa与pGC-cGMP-PKG信号通路间关系

3 讨论

钠尿肽通过作用于离子通道发挥多种生理功能，如C-型钠尿肽(CNP)通过调节毒蕈碱的活性来调节胃动力［11］。我们以往的研究发现，DNP通过增加钙激活钾电流实现抑制胃动力。钙离子通道在调节胃部平滑肌收缩方面发挥了重要的作用。Ca(v)1.2 L-型钙离子通道在心脏和平滑肌收缩方面是至关重要的［12］;NO-1886通过抑制钙离子通道减弱平滑肌的收缩导致血管舒张［13］;在消化道中，通过调节Ca(v)1.2 L-型钙离子通道控制小鼠的胃动力［14］。以上研究表明L-型钙通道和平滑肌收缩之间有密切关系。

在本研究中，运用多道生理记录仪及膜片钳技术，研究了DNP对豚鼠胃窦环形肌细胞上L-型钙通道电流的影响。结果显示，DNP抑制豚鼠胃窦环形肌自发性收缩活动并呈现剂量依赖关系。钡离子是钙离子良好的载流子，I-V曲线的形状和钙离子通道电流也是一致的，但电流幅度明显大于ICa。因此，在本研究中用IBa代替ICa进行研究。结果显示，DNP明显抑制豚鼠胃窦环形肌细胞上的IBa并呈剂量依赖关系，给予1、10、100 nmol/L的DNP后相对电流分别为对照组的(60.12±2.02)%、(57.12 ±3.02)%、(42.12 ±3.16)%。这表明 DNP抑制ICa是DNP抑制胃动力的影响因素之一，这与Sun 等［15］的报道一致。

用鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583预处理后，DNP对IBa的抑制效应明显降低，相对电流从用药前抑制到(67.12 ±4.02)% 减弱为(88.03 ±4.15)%;用蛋白激酶G的特异性抑制剂KT-5823预处理后，DNP引起的IBa的抑制效应明显减弱;而cGMP敏感的磷酸酯酶抑制剂zaparinast预处理后，DNP对 IBa的抑制作用由预处理前的(67.12±4.02)%增强为(53.00 ±4.23)%。

DNP通过cGMP信号通路发挥许多生理作用。DNP能通过增加cGMP舒张人动脉和静脉平滑肌［16］，还可通过增加 cGMP 引起心肌细胞凋亡［17］。另据报道，细胞内cGMP不仅能激活蛋白激酶G，而且也能抑制磷酸二酯酶3的活性［18］，后者将导致cAMP的增加，cGMP也可直接作用于离子通道。Hirsch等［19］证实，在人肾上皮细胞上cGMP可直接抑制cGMP调控的钾通道，而不经过PKG介导的磷酸化过程。本研究发现，鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583、蛋白激酶G特异性抑制剂KT5823能明显减弱DNP对IBa的抑制作用，而cGMP敏感的磷酸酯酶抑制剂zaparinast能增强DNP对IBa的抑制作用。提示pGC-cGMP-PKG通路参与DNP抑制豚鼠胃窦环形肌细胞上IBa的过程。

总之，DNP能抑制豚鼠胃窦环形肌自发性收缩活动，其机制可能与激活pGC-cGMP-PKG通路有关。

［1］Yanoshita R.Structure and biological activities of peptides in the venom of snakes and sea anemones［J］.Seikagaku，2003，75(2):133-137.

［2］Singh G，Maguire JJ，Kuc RE，et al.Characterization of the snake venom ligand［125I］-DNP binding to natriuretic peptide receptor-A in human artery and potent DNP mediated vasodilatation［J］.Br J Pharmacol，2006，149(7):838-844.

［3］Singh G，Kuc RE，Maguire JJ，et al.Novel snake venom ligand dendroaspis natriuretic peptide is selective for natriuretic peptide receptor-A in human heart:downregulation of natriuretic peptide receptor-A in heart failure［J］.Circ Res，2006，99(2):183-190.

［4］Ha KC，Piao CS，Chae HJ，et al.Dendroaspis natriuretic pepti deprotects the post-ischemic myocardial injury［J］.Regul Pept，2006，133(1-3):13-19.

［5］Gao YL，Xin HN，Feng Y，et al.Human plasma DNP level after severe brain injury［J］.Chin J Traumatol，2006，9(4):223-227.

［6］Lee S，Park SK，Kang KP，et al.Relationship of plasma dendroaspis natriuretic peptide-like immunoreactivity and echocardiographic parameters in chronic haemodialysis patients［J］.Nephrology(Carlton)，2004，9(3):171-175.

［7］Kim JH，Yang SH，Yu MY，et al.Dendroaspis natriuretic peptide system and its paracrine function in rat colon［J］.Regul Pept，2004，120(1-3):93-98.

［8］Guo HS，Cai ZX，Wu TH，et al.Inhibitory effect of Dendroaspis natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscles of guinea pigs［J］.Acta Pharmacol Sin，2007，28(11):1797-1802.

［9］Wrzos HF，Tandon T，Ouyang A.Mechanisms mediating cholinergic antral circular smooth muscle contraction in rats［J］.World J Gastroenterol，2004，10(22):3292-3298.

［10］Karaki H，Sato K，Ozake H，et al.Effects of sodium nitroprusside on cytosolic calcium level in vascular smooth muscle［J］.Eur J Pharmacol，1988，156(2):259-266.

［11］Xing DG，Huang X，Li CH，et al.Muscarinic activity modulated by C-type natriuretic peptide in gastric smooth muscles of guinea-pig stomach［J］.Regul Pept，2007，143(1-3):83-89.

［12］Tang ZZ，Liao P，Li G，et al.Differential splicing patterns of L-type calcium channel Cav1.2 subunit in hearts of spontaneously hypertensive rats and Wistar Kyoto Rats［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1783(1):118-130.

［13］Nakamura A，Harada N，Takahashi A，et al.NO-1886，a lipoprotein lipase activator，attenuates vascular smooth muscle contraction in rat aorta［J］.Eur J Pharmacol，2007，554(2-3):183-190.

［14］Weqener JW，Schulla V，Koller A，et al.Control of intestinal motility by the Ca(v)1.2 L-type calcium channel in mice［J］.FASEB J，2006，20(8):1260-1262.

［15］Sun JB，Huang X，Xu HY，et al.Inhibitory effect of C-type natriuretic peptide on L-type calcium channel currents in gastric antral myocytes of guinea pigs［J］.Gen Physiol Biophys，2006，25(4):365-377.

［16］Best PJ，Burnett JC，Wilson SH，et al.Dendroaspis natriuretic peptide relaxes isolated human arteries and veins［J］.Cardiovasc Res，2002，55(2):375-384.

［17］Ha KC，Chae HJ，Piao CS，et al.Dendroaspis natriuretic peptide induces the apoptosis of cardiac muscle cells［J］.Immunopharmacol Immunotoxicol，2005，27(1):33-51.

［18］Degerman E，Belfrage P，Manganiello VC.Structure，localization，and regulation of cGMP-inhibited phosphodiesterase(PDE3)［J］.J Biol Chem，1997，272(11):6823-6826.

［19］Hirsch JR，Weber G，Kleta I，et al.A novel cGMP-regulated K+channel in immortalized human kidney epitheliall cells(IHKE-1)［J］.J Physiol，1999，519(Pt 3):645-655.