番鸭细小病毒荧光定量PCR方法的建立及初步应用

谢丽基，谢芝勋，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢志勤，范 晴

（广西壮族自治区兽医研究所，广西南宁 530001）

番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）可以引起1周龄～3周龄雏番鸭发病，致死率可达到50%～80%，是危害番鸭养殖的重要病原[1]。

MDPV传统的检测方法包括血清中和试验、琼脂扩散试验、ELISA和地高辛探针检测等[2-5]，但这些方法存在耗时长、敏感性较低、不易标准化等不足，在实际应用中具有一定的局限性。现已建立的MDPV PCR[6]和LAMP检测方法[7]，检测的速度和敏感性优于相对传统的检测方法。

荧光定量PCR具有敏感性高、特异性强、可以定量检测等优点。目前，尚未有应用荧光定量PCR技术对MDPV进行检测的报道，本研究设计了特异性引物，建立MDPV荧光定量PCR快速检测方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株 鸭I型肝炎病毒AV2111株（DHV AV2111）购自中国兽医药品监察所；MDPV、鸭圆环病毒（DuCV）、小鹅瘟病毒（GPV）、鸭副粘病毒（DPMV）、鸭瘟病毒（DPV）和H9亚型禽流感（AIV H9）等均由本实验室保存。

1.2 主要试剂 DNA片段回收试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自BioDev公司；pGEM-T Easy试剂盒购自Promega公司；T7体外转录试剂盒购自Fermengtas公司；Prem ix ExTaqTM试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；TIANamp病毒基因组 DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.3 引物与TaqMan探针的设计与合成 根据GenBank中MDPV的REP基因保守序列，采用Primer Express 3.0软件，设计一对特异性引物MDPV1590： 5'-TGAGCTCTTTGCTTCAGTTGCT-3'和MDPV1642：5'-CCCACGGGTTTTCTTTCTCTT-3'，及一条TaqMam探针MDPV1613T：5'-FAM-CTCTGCC TTCCAGTCCGGACACATCT-BHQ1-3'，引物和探针由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.4 标准品的制备

1.4.1 核酸的提取参照TIANamp病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取MDPV、DHV AV2111、DuCV、GPV、DPMV、DPV和AIV H9的DNA或RNA。

1.4.2 PCR扩增的体系和条件使用引物MDPV571-1：5'-ATAAAGTAGTGGAATCCGCAAAAG-3'和引物 MPDV571-2：5'-TCCAGGCATTCAAAAACA TTCATA-3'，对MDPV的REP基因进行PCR扩增，目的片段为571 bp。反应条件为：95℃5m in；94℃60 s、50℃60 s、70℃60 s，35个循环；72℃10min。产物经2%琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段后克隆至pGEM-T Easy载体中，阳性克隆菌（pGEM-MDPV）由宝生物工程（大连）有限公司测序。提取pGEM-MDPV重组质粒作为阳性标准品，按照文献[8]计算重组质粒的拷贝数。

1.5 荧光定量PCR的反应条件 以pGEM-MDPV作为标准品，引物和探针在终浓度为0.2 umol/L～0.8 umol/L之间，进行不同浓度的配比并进行荧光定量RT-PCR扩增，选择引物和探针的最佳浓度。荧光定量PCR反应的温度转换率为20℃/s，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。反应程序为：95℃ 10 s、60℃20 s，50个循环；40℃结束反应。

1.6 荧光定量PCR的标准曲线及敏感性 将pGEM-MDPV作标准品10倍系列稀释后进行荧光定量PCR扩增，并与常规PCR方法[9]进行比较。

1.7 荧光定量PCR的特异性试验 利用本研究建立的荧光定量PCR检测方法，对MDPV的核酸以及对照病原（DHV AV2111、DuCV、GPV、DPMV、DPV和AIV H9）的核酸进行特异性检测。

1.8 重复性试验 将1×107copies/μL、1×105copies/μL和1×103copies/μL的MDPV阳性样品分3个标本同时检测。通过计算Ct值的标准差（SD）和变异系数（CV）来验证荧光定量PCR的批内重复性。3 d后重复检测保存于-20℃的模板，验证模板的稳定性及荧光定量PCR的批间重复性。

1.9 临床样品的检测 采用建立的荧光定量PCR方法，对2011年于广西地区鸭群收集的118份鸭肝脏组织进行检测，并同时对病料样品进行病毒分离鉴定，评价其临床实用性。

2 结 果

2.1 引物、探针浓度的优化 不同的引物和探针终浓度配比试验结果显示，不同的引物和探针终浓度对试验结果影响比较大，当MDPV上、下游引物终浓度分别为0.2 umol/L、探针终浓度为0.4 umol/L时，对质粒标准品的检测可以获得较小的Ct值。

2.2 标准曲线及敏感性试验 以10倍系列稀释的MDPV重组质粒 （1×108copies/μL～1×101copies/μL）为模板进行扩增，敏感性结果及标准曲线见图1。结果显示，对MDPV 1×101copies/μL模板的检测仍有荧光曲线，表明该检测方法对MDPV的灵敏度为20 copies，比常规PCR方法（图2）敏感性高100倍，重复检测的结果一致。标准曲线呈线性，扩增有效率为0.995，误差为0.0243，表明所建立的方法具有很好的扩增效率。

图1 敏感性及标准曲线Fig.1 Sensitivity and the standard curve of the real-time PCR

图2 常规PCR检测MDPV的敏感性Fig.2 Sensitivity of the conventional PCR for MDPV

2.3 荧光定量PCR的特异性试验 本研究建立的荧光定量PCR方法仅对MDPV的检测为阳性，而对照病原（DHV AV2111、DuCV、GPV、DPMV、DPV和AIV H9）的检测均为阴性（图3），表明该方法特异性强，与其它检测对象无交叉反应。

图3 检测MDPV的特异性Fig.3 The specificity of MDPV

2.4 重复性试验 采用本研究建立的方法对1×107copies/μL、 1×105copies/μL和 1×103copies/μL的MDPV阳性样品进行批内和批间试验，变异系数均小于2%（表3）。结果表明该方法具有良好的准确性和重复性。

表3 荧光定量PCR的批内和批间重复性试验结果Table 3 Intra-assay and inter-assay reproducibility test of the real-time PCR

2.5 荧光定量PCR检测临床病料样品 利用建立的荧光定量PCR方法对广西地区鸭群收集的118份病料样品进行检测，结果MDPV 13份阳性（阳性率为11.02%），检测结果与病毒分离鉴定结果一致。

3 讨 论

MDPV是危害雏鸭的最重要病原，并且感染发病后致死率非常高，因此迫切需要建立一种快速、敏感的MDPV检测方法，在感染早期就能够检测出病原，从而为MDPV的控制争取宝贵的时间。荧光定量PCR技术实现了对模板的定量，而且具有敏感、特异、准确可靠、能实现多重反应和实时性好等特点[10]。

本研究通过Primer Express 3.0软件，设计并筛选出特异的探针和引物。对探针和引物的浓度进行优化，建立了MDPV的荧光定量PCR方法。该方法的扩增过程仅需要约30 min，并且反应结果可以直接通过电脑分析判断，因此本研究建立的MDPV荧光定量PCR方法具有比常规方法更加快速的优点。另外，本实验建立的方法可以对样品中相应的病原含量进行定量；检测的敏感性高，可以检测到20 copies的MDPV，比常规PCR方法敏感性高100倍，可以用于MDPV疫苗和药物疗效的评估，以及其致病机理等方面的研究，因此该方法的建立对MDPV的防制有重要意义。

采用建立的荧光定量PCR方法，对广西地区鸭群收集的118份病料样品进行检测，结果MDPV阳性率为11.02%，显示广西地区的鸭群MDPV感染普遍。该荧光定量PCR方法的建立对广西地区鸭群的疫病控制有一定意义。

[1]刘文波，柴同杰.雏番鸭细小病毒研究进展[J].中国家禽，2001，23（13）：33-35.

[2]娄华，白挨泉，陆英杰，等.应用琼脂免疫扩散试验检测番鸭细小病毒抗体[J].中国兽医科技，2000，30（8）：22-23.

[3]胡奇林，程由铨，陈少莺，等.四种检测番鸭细小病毒抗原方法的比较[J].福建畜牧兽医，2000，22（2）：4-6.

[4]Zhang Yun,Li Yong-feng,Liu Ming,et al.Development and evaluation of a VP3-ELISA for the detection of goose and muscovy duck parvovirus antibodies[J].J Virol Methods,2010,163（2）:405-409.

[5]Gall-Recule G L,Jestin V.Production of digoxigenin-labelled DNA probe for detection of muscovy duck parvovirus[J].Mol Cell Probes,1995,9（1）:39-44.

[6]娄华，杨德威，贺东升，等.番鸭细小病毒与鹅细小病毒的PCR鉴别诊断[J].中国预防兽医学报，2000，22（6）：458-460.

[7]Ji J,Xie Q M,Chen C Y,et al.Molecular detection of Muscovy duck parvovirus by loop-mediated isothermal amplification assay[J].Poult Sci,2010,89:477-483.

[8]谢芝勋，谢丽基，刘加波，等.禽流感和新城疫病毒二重荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J].生物技术通讯，2008，19（3）：410-413.

[9]张伟，季艳菊，陈芳艳，等.番鸭细小病毒型“白点病”PCR检测方法的建立与初步应用[J].广东畜牧兽医科技，2008，33（6）：18-23.

[10]Xie Zhi-xun,Xie Li-ji,Pang Yao-shan,et al.Development of a real-timemultiplex PCR assay for detection of viral pathogens of penaeid shrimp[J].Arch Virol,2008,153:2245-2251.