猪流行性腹泻病毒N蛋白核仁定位信号对宿主细胞周期的影响

刘随新，石 达， 陈建飞， 张 鑫，时洪艳，刘孝珍,2，张 莎,2，王 璐，冯 力*

（1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001；2.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150030）

猪流行性腹泻（Porcine epidem ic diarrhea，PED）是由PED病毒（PEDV）引起的一种急性高度接触性肠道传染病，以肠炎为主要特征，对仔猪致死率高达90%[1]，给养猪业造成了严重的经济损失。

PEDV属于α冠状病毒属，基因组为具有感染性的单股正链RNA，5'端具有帽子结构，3'端具有Poly（A）序列。PEDV主要的结构蛋白包括：纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）和小膜蛋白（E）[2]。其中PEDV N蛋白是一种磷酸化的并富含碱性氨基酸的结构蛋白，可以定位于细胞的核仁中，同时推测N蛋白可能参与细胞核仁的功能调节，干扰宿主细胞的周期，从而为病毒的复制提供条件[3-5]。

本研究根据本实验室前期工作鉴定的核仁定位信号，构建核仁定位信号缺失重组质粒pAc-GFP-dN，转染Vero E6细胞，利用激光共聚焦显微镜和流式细胞术观察核仁定位信号缺失的N蛋白的定位情况和转染细胞的周期变化，进而为N蛋白核仁定位信号对宿主细胞的影响提供了实验依据，为进一步研究PEDV的致病机制奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 重组质粒、菌株和细胞 含有编码PEDV N基因的重组质粒pMD-N、真核表达载体pAc-GFP-C1、感受态E.coliDH5α和Vero E6细胞由本实验室保存。

1.2 主要试剂 限制性内切酶、T4DNA连接酶购自美国NEB公司；PrimerSTAR HS DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；DMEM培养基、OPTI-MEM培养基和胎牛血清均购自Hyclone公司；质粒抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自QIAGEN公司；细胞培养板购自Greierbio-one公司。

1.3 重组质粒的构建及鉴定 根据PEDV CV777株 N基因的全序列设计引物 N1U、N1L、N2U、N2L。以N1U和 N2L引物[N1U：5'-CCCAAGCTT ACCATGGCTTCTGTCAGCTTTC-3'（HindⅢ），N2L：5'-GGGCGGGATCCTTAATTTCCTGTGTCGGAG-3'（BamHⅠ）]，扩增N基因，大小为1 326 bp。

核仁定位信号序列编码区位于N基因的211 bp～270 bp，共60 bp，N基因中核仁定位信号上游序列命名为N1，大小为210 bp，PCR扩增引物为N1U和N1L（5'-CAGAAAACACCCTCAGTACGAGGTTGT TCAATTCGCTCAC-3'）；核仁定位信号下游序列命名为N2，大小为1 056 bp，PCR扩增引物为N2U（5'-GTGAGCGAATTGAACAACCTCGTACTGAGGG TGTTTTCTGG-3'）和N2L。将分别扩增的N1和N2按照凝胶回收试剂盒说明书进行凝胶回收，并以其为模板，以N1U和N2L为引物利用SOE-PCR的方法扩增核仁定位信号序列缺失基因dN。。

将PCR扩增产物dN和N基因采用凝胶回收，将两种回收产物和pAC-GFP-C1载体分别进行HindⅢ和BamHⅠ双酶切，回收酶切产物，按照5∶1的分子比例16℃连接过夜，转化感受态E.coliDH5α，培养后，提取重组质粒，由上海英俊生物技术有限公司测序。

1.4 转染Vero E6细胞 将重组质粒转染于60%～80%融合度的无抗生素培养的Vero E6细胞中。按LipofectamineTM2000说明书进行细胞转染。

1.5 共聚焦显微镜分析 重组质粒转染48 h后，弃培养液，细胞用冰预冷的50%甲醇和50%丙酮的固定液室温固定15 min，用PBS漂洗3次，每次5min，自然干燥，加入DAPI（100μg/mL），于4℃避光染核15 min，PBS漂洗3次，利用激光共聚焦显微镜分析核仁定位信号缺失后N蛋白在细胞内的定位情况。

1.6 流式细胞术检测宿主细胞周期的变化 重组质粒转染48 h后，弃培养液，用胰酶消化于1.5 ML离心管中，2 000 r/min 4℃离心5 min，PBS漂洗3次。按照说明书进行细胞的染核，利用流式细胞仪（FASCAria）检测细胞周期的变化。

2 结 果

2.1 N基因和dN基因的扩增 以pMD-N为模板，利用设计的特异引物扩增得到与预期大小相符的dN和N基因（图1）。

2.2 激光共聚焦显微镜分析dN蛋白在细胞中的定位情况 将pAc-GFP、pAc-GFP-N及pAc-GFP-dN分别转染于Vero E6细胞中，48 h后，利用激光共聚焦显微镜分析。激光共聚焦显微镜图片显示，在转染空载体pAc-GFP细胞中可以在细胞核质和细胞质中观察到绿色荧光，在转染pAc-GFP-N的细胞中，可以在细胞核仁及细胞质中观察到绿色荧光，而在转染pAc-GFP-dN的细胞中，则只能在细胞质中发现绿色荧光（图2），结果表明核仁定位信号的缺失导致dN蛋白丧失了在细胞核仁中定位的能力。

图1 dN和N基因扩增结果Fig.1 Amplification of N and dN genes by PCR

图2 激光共聚焦分析dN蛋白在细胞浆中的定位结果Fig.2 The subcellular localization of the expressed dN protein in cytoplasm of the transfected Vero E6 cells by confocal Microscope observation

2.3 细胞流式仪检测dN蛋白对细胞的周期变化影响 将pAc-GFP、pAc-GFP-N及pAc-GFP-dN分别转染于Vero E6细胞中，48 h后，利用流式细胞仪检测。结果表明，空白细胞对照组G0/G1期、S期及G2/M期细胞分别为60.4%、15.9%和10.1%；空载体对照组G0/G1期、S期及G2/M期细胞分别为58.1%、13.9%，13.4%；在转染pAc-GFP-N细胞中G0/G1期、S期及G2/M期分别为57.9%、13.5%和20.5%，与空白细胞对照组，空载体对照组相比较显示：G2/M期明显增多。而转染pAc-GFP-dN细胞中G2/M期细胞则与正常对照组细胞相似，G0/G1期为61.9%，S期为12.0%，G2M期为11.9%（图3）。结果表明N蛋白可以调节细胞周期，使其在G2M期出现停滞现象，而核仁定位信号缺失之后，N蛋白丧失了使宿主细胞周期在G2/M期停滞的能力，表明N蛋白核仁定位信号在宿主细胞周期调节中起到重要作用。

图3 流式细胞仪检测dN蛋白对细胞周期影响结果Fig.3 Effection of the expressed dN protein on cell cycle by Flow Cytometry

3 讨 论

N蛋白为冠状病毒的主要结构蛋白之一，由377个至455个氨基酸组成，以具有高等电点、高丝氨酸含量为特征，是一种多功能的磷酸化蛋白，与病毒基因组RNA相互缠绕形成核衣壳，有6个～7个潜在的磷酸化位点，3个相对保守的结构域，位于中间的一个结构域能够与病毒的RNA前导序列结合，在病毒RNA合成过程中发挥着重要的作用。在感染病毒细胞中，N蛋白是表达量最高的病毒蛋白之一[6-8]。

作为单股正链RNA病毒，PEDV可以在宿主细胞的细胞质中完成所有的复制过程，但研究表明，在宿主细胞的细胞核中也可以发现病毒的N蛋白，这表明N蛋白中存在引导蛋白到细胞核中定位的信号，N蛋白借助这些信号和载体蛋白相互作用从而进入细胞核。大量的研究表明N蛋白借助核（核仁）定位信号转移到细胞核仁中参与细胞分离期的调节，从而有利于病毒的复制。Chen等研究推断人呼吸系统冠状病毒（SARS-CoV）N蛋白与核仁蛋白和纤维蛋白相互作用，使其重新分布，并抑制细胞的分裂[9]，Wurm等推定鼠肝炎病毒和猪传染性胃肠炎病毒N蛋白可能延迟细胞周期来创造有利病毒复制的适宜条件[10-13]。

本研究根据本实验室前期鉴定的核仁定位信号，即位于N基因的核苷酸序列的第211位～270位，共60个核苷酸，利用激光共聚焦显微镜观察，确定缺失核仁定位信号的N蛋白丧失了在细胞核仁中定位的功能；并进行流式细胞仪的检测，可观察到转染含有完整核仁定位信号的N蛋白后，宿主细胞在G2/M期明显增加，而转染缺失核仁定位信号的dN蛋白的细胞，与正常细胞相似，在G2/M期无明显增加的现象。这与其他冠状病毒N蛋白对宿主细胞周期的影响相似，表明N蛋白通过在核仁中定位来调节宿主细胞的周期变化，从而有利于病毒在其体内的复制。同时对核仁定位信号的初步分析为进一步研究PEDV致病机制的阐明和基因疫苗的研制提供了新的依据。

[1]Pensaert MB,Debouck P.A new coronavirus-like particle associated w ith diarrhea in sw ine[J].Arch Virol,1987,58（3）:243-247.

[2]陈建飞，冯力，时红艳，等.猪流行性腹泻病毒株蛋白基因的遗传变异及其原核表达[J].中国预防兽医学报，2007，29（11）：856-861.

[3]Surjit M,Lal S K.The SARS-CoV nucleocapside protein:a protein w ith multifarious activities[J].Infect Genet Evol,2008,8（4）:397-405.

[4]Dove B K,You J H,Reed ML,et al.Changes in nucleolar morphology and protein during infection with the coronavirus infectious bronchitis virus[J].Cell Microbiol,2006,8（7）:1447-1157.

[5]Reed Ml,Dove B K,Jackson R M,et al.Delineation and modelling of a nucleolar retention signal in the coronavirus nucleocapside protein[J].Traffic,2006,7:833-848.

[6]Calvo E,Escors D,Lopez J A,et al.Phosphorylation and subcellular localization of transm issible gastroenteritis virus nucleocapside protein in infected cell[J].J Gen Virol,2005,86:2255-2267.

[7]Chen Hong-ying,Gill A,Dove B K,et al.Mass spectroscopic characterization of the coronavirus infectious bronchitis virus nucleoprotein and elucidation of the role of phosphorylation in RNA binding by using surfaceplasmon resonance[J].J Virol,2005,79（2）:1164-1179.

[8]Jayaram J,Youn S,Collission E W.The virion Nprotein of infectious bronchitis virus ismore phosphorylatde than the N protein from infected cell lysates[J].Virology,2005,339:127-135.

[9]Chen Hong-ying,Wurm T,Britton P,et al.Interaction of the coronavirus nucleoprotein w ith nucleolar antigens and the host cell[J].JVirol,2002,76:5233-5250.

[10]Singh M.A novel internal open reading frame product expressed from a polycistronic of porcine epidem ic diarrhea virusmay not contribute to virus attenuation[J].J Gen Virol,1999,80:1959-1963.

[11]Wurm T,Chen Hong-ying,Hodgson T,et al.Localization to the nucleolus is a common feature of coronavirus nucleoproteins and the protein may disrupt host cell division[J].JVirol,2001,75:9345-9356.

[12]Hiscox J A,Wurm T,W ilson L,et al.The coronavirus infectious bronchitis virus nucleoprotein localizes to the nucleolus[J].JVirol,2001,75:506-512.

[13]Yoo D,Wootton S K,Gang Li,et al.Colocalization and interaction of the porcine arterivirus nucleocapsid protein w ith the small nucleolar RNA associated protein fibrillarin[J].J Virol,2003,77（22）:12173-12183.