芩麻方中各味药材对麻黄提取效率的影响研究

张若曦， 丁 越， 张 彤， 王庆其， 邹纯朴， 陶建生

(上海中医药大学，上海 201203)

芩麻方为上海中医药大学教授、名老中医裘沛然的经验方。由麻黄、细辛、龙胆、黄芩、干姜、诃子、甘草组成。本方在小青龙汤基础上，以麻黄宣肺平喘为君药;细辛、干姜性辛温，功能温肺化饮，合龙胆草、黄芩清热燥湿，两组寒热并用，相反相成为臣药;诃子敛肺止咳，与麻黄相配伍，一散一收，相激而成，为佐药;甘草调和诸药。故本方具有寒热并用，敛散相伍的配伍特点，主治寒邪痰热内蕴之哮喘、咳嗽。现代临床多用于支气管哮喘以及慢性支气管炎的治疗。麻黄作为芩麻方中的君药，其主要成分盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱常被看作是该方的药用基础之一，具有舒张支气管平滑肌和抗炎抗病毒作用作用，可以有效地治疗支气管哮喘和慢性支气管炎［1-4］。在采用现代制药技术开发芩麻方新药的研究过程中，发现芩麻方中其他药材与麻黄混煎时，对麻黄中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的提取效率有一定的影响。因此，本实验以麻黄中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的提取效率为指标，建立麻黄提取液及药材中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的测定方法，研究芩麻方中各味药材对麻黄中有效成分提取效率的影响，优化芩麻方中麻黄的提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1200 series高效液相色谱仪 (VWD检测器、四元恒流泵、在线脱气机、自动进样器)，美国安捷伦公司;XS105DU电子天平，梅特勒-托利多 (中国)，SB3200超声波清洗器，宁波新芝生物科技公司，色谱柱为Welch Materials:XB-C18色谱柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

1.2 药品及试剂 麻黄药材 (购于康桥饮片厂，经上海中医药大学教学实验中心李俊松高级实验师鉴定为麻黄科植物草麻黄Ephedra sinicaStapf的干燥草质茎);盐酸麻黄碱对照品，盐酸伪麻黄碱对照品购自中国食品药品检定研究院，批号171241-201007、171237-200807，供定测使用;甲醇为色谱纯;水为纯净水;其他试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

2 麻黄提取液及药材中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱HPLC测定方法的研究

2.1 麻黄提取液的制备 取麻黄药材50 g，精密称定质量，加10倍量水，浸渍30 min，煎煮3次，每次1 h，滤过，合并3次滤液，按药材比量法浓缩至2 g/mL，即得麻黄水煎液。

2.2 盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱HPLC测定方法

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品7.95 mg、8.20 mg(纯度分别为99.7%和99.9%)，置于50 mL量瓶中，用0.1 mol/L的盐酸溶解并定容至刻度，得质量浓度分别为0.159、0.164 mg/mL的混合对照品溶液，作为母液，4℃保存。

2.2.2 供试品溶液的制备 麻黄药材供试品的制备:参考《中国药典》2010年版一部麻黄项下收载的含量测定样品制备方法［5］。

麻黄提取液供试品的制备:取2.1项下麻黄提取液1 mL，加浓氨水2.5 mL(pH值约为10)，振摇，精密加入三氯甲烷50 mL，称定质量，超声处理30 min，放冷，称定质量，用三氯甲烷补足减失的质量，振摇，滤过，弃去初滤液。精密量取续滤液25 mL，加盐酸乙醇 (1→20)溶液4 mL(pH值呈酸性)，置水浴上蒸干，残渣加0.1 mol/L盐酸溶液溶解，转移至25 mL量瓶中并定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过即得样品。

2.2.3 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 (Welch Materials:XB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm);甲醇-0.1%磷酸水溶液 (含0.1%的三乙胺)10∶90为流动相;检测波长207 nm。理论板数按盐酸麻黄碱峰计均不低于4 000，色谱图见图1。

麻黄水提液和复方芩麻方提取液样品色谱图中具有与盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品保留时间一致的色谱峰，且与其他成分的色谱峰分离良好，且在复方芩麻方阴性样品色谱图中，未见干扰。

图1 标准品 (A)、麻黄提取液 (B)、芩麻方提取液 (C)、芩麻方阴性样品 (D)色谱图

2.2.4 线性关系考察 以2.2.1项下制备的对照品溶液为母液，依次稀释2倍，分别配制成盐酸麻黄碱质量浓度为2.48、4.97、9.94、19.88、39.75、79.50、159 μg/mL 和盐酸伪麻黄碱质量浓度为2.56、5.13、10.25、20.50、41、82、164 μg/mL的对照品溶液。分别吸取上述的对照品溶液各20 μL，进样测定，每个质量浓度重复进样3针。以各质量浓度下峰面积均值为纵坐标Y(mV·s)，麻黄碱的质量浓度为横坐标X(μg/mL)，绘制标准曲线，拟合方程分别为Y=38.72X+8.160 7(n=7)，r=1和Y=39.183X+6.940 8(n=7)，r=1，在2.48～159 μg/mL 和2.56～164 μg/mL的质量浓度范围内盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.5 精密度试验

2.2.5.1 日内精密度 取3个不同质量浓度水平的对照品溶液 (其中盐酸麻黄碱质量浓度分别为81.50、20.38、5.09 μg/mL，盐酸伪麻黄碱质量浓度分别为80.50、20.13、5.03 μg/mL)20 μL，重复进样6次，测定盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的峰面积，计算盐酸麻黄碱各质量浓度下平均峰面积分别为242.5、967.7、3 916.4，RSD值为0.1%、0.1%、0，盐酸伪麻黄碱各质量浓度下平均峰面积分别为239.2、955.8、3 871.4，RSD值为0.1%、0、0。

2.2.5.2 日间精密度 取上述溶液，每个质量浓度在连续5 d内，每天分别进样1针，计算盐酸麻黄碱各质量浓度下平均峰面积分别为 244.8、972.4、3924.3，RSD值为0.6%、0.8%、0.9%，计算盐酸伪麻黄碱各质量浓度下平均峰面积分别为241.6、960.6、3878.8，RSD值为1.0%、0.6%、0.9%。说明该测定方法精密度良好。

2.2.6 重复性 取麻黄水煎液样品1 mL，按2.2.2项进行供试品溶液制备方法处理，并进行HPLC测定，以标准曲线法定量并计算样品中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的质量浓度，平行操作六份，计算平均值与RSD值，结果盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱平均质量浓度为106.1 mg/mL和51.9 mg/mL，RSD值为0.2%、0.3%，该测定方法重复性良好。

2.2.7 稳定性 取麻黄提取液样品1 mL，按2.2.2项下制备供试品溶液1份，于样品制得后的0、1、2、4、8、12与24 h进样测定，记录各时间点盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的峰面积，并计算RSD值，经计算各质量浓度下盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱平均峰面积为1 049.8和515.0，RSD值为0.8%和0.6%，说明供试品溶液中盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱在制备完成24 h内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率 采用加样回收率实验方法，取已知量的麻黄水煎液，分别加入不同量的盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱 (80%、100%、120%)，按加样样回收实验计算回收率，盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱的回收率分别为103.0%和97.2%，RSD值为1.4%和1.1%。说明本法具有良好的回收率，见表1，表2。

表1 麻黄提取液中盐酸麻黄碱加样回收率试验 (n=9)

表2 麻黄提取液中盐酸伪麻黄碱加样回收率试验 (n=9)

3 芩麻方中各味药材对麻黄中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的提取效率的影响

将麻黄与芩麻方中其他药材 (黄芩、甘草、细辛、龙胆、诃子、干姜)按1∶1比例50 g，按2.1项下麻黄提取液制备方法制备混煎水提液，结果见表3。提取效率按混煎液盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的量与50 g麻黄提取液的量之比来计算。

表3 芩麻方中各味药材对于麻黄提取的影响 (n=3)

实验结果显示，麻黄与各味中药分别混合煎煮后，芩麻方中的黄芩、细辛、龙胆、诃子、甘草均在一定程度上降低了麻黄有效成分的提取率;甘草对麻黄提取的影响最大，二药合煎时盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱的提取效率分别为39.3%和31.7%，有效成分损失严重。本实验采用麻黄药材单独煎煮提取来优化其工艺参数，以提高有效成分的提取率，提高制剂的临床疗效。

4 麻黄水提工艺正交试验

预实验结果表明，影响其水提效果因素主要有药材的浸泡时间，煎煮时间和用水量等。通过正交实验优选水煎提取的最佳工艺，正交实验设计见表4。

表4 正交试验设计

根据各指标影响作用的大小，本实验依据其重要程度设置权重，盐酸麻黄碱提取率∶盐酸伪麻黄碱提取率=0.5∶0.5，计算各指标的P(Bi/Aj)，P(Bi/Aj)=Xij/Sij，综合评分 (M)=0.5×P(B1/A1)+0.5×P(B2/A2)，上述各式中Bi为第i号实验，Aj为第j个指标，Xij表示第j个指标下第i个测定值，Sj表示第j个指标下各次实验结果的和值 (i=1，2，…，n，j=1，2，…，k)。见表5，表6。

表5 正交实验设计表及结果

表6 综合评价正交实验方差分析结果

直观分析结果显示三因素的主次关系为B＞C＞A，最佳的工艺搭配为B3C3A1。由于因素A、C的离差平方和均小于误差项因素D，故将其并入误差项计算。综合评价方差分析结果表明，麻黄水提过程中，煎煮时间 (B)为显著性影响因素，选择B3，药材的浸泡时间 (A)、用水量(C)无显著性影响，可根据生产实际情况适当调整。优选的工艺条件为药材加水浸泡0.5 h，煎煮3次，每次煎煮1.5 h，每次用水量为药材的10倍量。

5 最佳提取工艺确定与验证

按正交分析实验优选提取工艺进行水提工艺验证，平行制备3批样品。测定水提液中盐酸麻黄碱转移率、盐酸伪麻黄碱转移率和浸膏得率，结果3批样品中盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱的转移率分别为79.4%、79.2%、79.8%和76.0%、75.9%、76.7%，RSD为0.57%和0.38%，表明麻黄水提工艺稳定，见表7。

表7 最佳提取工艺确定与验证

6 讨论

麻黄提取液测定方法的考察时，以盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱提取率为指标考察了乙醚萃取法、三氯甲烷萃取法、三氯甲烷超声法、氧化铝柱层析法4种不同供试品的制备方法［6-11］。结果显示同一份麻黄水煎液，三氯甲烷超声法制备的样品中盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱测定的量最高，又经空白盐酸麻黄碱对照品测定其萃取回收率为97.8%，故麻黄提取液供试品制备采用三氯甲烷超声法。

采用HPLC建立的麻黄药材及提取液中盐酸麻黄碱与盐酸伪麻黄碱的测定方法，样品处理方法便捷，测定方法简单，测定结果准确可靠，具有良好的重复性和回收率，可用于麻黄饮片和麻黄制剂中的质量控制。

麻黄与各味中药混合煎煮结果表明:复方芩麻方中的黄芩、细辛、龙胆、诃子、甘草均在一定程度上降低了麻黄有效成分的提取率，其中甘草对麻黄提取效率的影响最大，麻黄—甘草为酸碱药对，合煎过程中可能产生沉淀导致化学成分变化，尤其是水煎液中的去甲基伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、麻黄碱、伪麻黄碱、甲基麻黄碱5种生物碱的量均有不同程度的降低。推测可能因为甘草中的甘草酸与麻黄中的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱结合并生成沉淀，影响了本实验对芩麻方有效成分盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的提取。这与李外等［12-14］的研究结果一致。

由于芩麻方提取时，各药味间存在相互作用，如考虑盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱的提取率，君药麻黄应与对甘草等药味分别提取，以提高制剂的临床疗效。本实验通过正交试验优选的最佳提取工艺为取适量的药材，每次加水量为药材的10倍量，煎煮3次，每次煎煮1.5 h。

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