四君子汤传统煎煮规范化研究

徐秋香， 郁红礼，2，3， 吴 皓，2，3*， 潘耀宗， 宫 乐， 赵腾斐， 尤奋强

(1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210029;2.江苏省中药炮制重点实验室，江苏 南京 210019;3.国家教育部中药炮制规范及标准工艺研究中心，江苏 南京210019;4.昆山市中医院，江苏 昆山 215300)

汤剂是我国临床应用最早、最广的一种剂型，可适应中医的辨证施治、随症加减的原则，具有吸收快，作用强的优点［1］。中药疗效除了与药材的质量、炮制方法相关外，煎煮方法尤为关键。正如李时珍所说:“凡服汤药，虽品物专精，修治如法，而煎药者鲁莽造次，水火不良，火候失度，则药亦无功”［2］;清代医家徐灵胎:“煎药之法最宜深讲，药之效与不效，全在于此”［3］。通过查阅大量文献，同时对临床煎煮情况进行调研，发现各地煎煮方法差异大。临床医生、药房、汤剂煎煮等相关行业人员大多未有可靠又具事实依据的说法。针对这一现状，国家中医药管理局行业专项对中药汤剂传统煎煮方法进行规范化系统研究，目的是制定合理的煎煮操作流程，提高汤剂质量。

四君子汤出自宋代《太平惠民和剂局方》，由人参、白术、茯苓、甘草组成，具益气健脾之功，主治脾胃气虚证，是补气基本方［4］。据文献报道四君子汤有效成分为黄酮类、皂苷类、多糖类及有机酸类等成分［5］，有学者应用液相串联质谱、质谱-质谱串联技术对复方四君子汤进行研究，结果表明四君子汤的水溶性成分主要来源于君药人参和使药甘草［6］，结合2010版《中国药典》中人参和甘草质量标准中含量测定指标，选择汤剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和甘草酸为指标性成分，并结合汤剂的相对密度和浸出物两个整体指标，本实验以四君子汤为研究对象，以浸泡时间、煎煮时间、加水量及煎煮次数为考察因素［7］，采用L9(33)正交设计对四君子汤传统煎煮工艺进行多指标综合优选。并比较特殊药物人参另煎和不另煎方法对汤剂质量的影响，研究不同煎煮器具 (砂锅、养生壶、不锈钢锅)和煎煮火候 (先武后文、一直文火)对汤剂质量的影响［8-9］。本方煎煮的规范化研究，将对补益类中药汤剂煎煮，特别是贵重药物的另煎特殊煎煮方法，提供规范化研究的借鉴。

1 材料

Waters2695高效液相色谱仪;waters2589检测器;UNIQUE-S15超纯水发生器;BP211D电子天平 (德国Sartorius公司);KQ—500DE型医用数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司)。

人参皂苷Rg1对照品 (批号110703-201027)、人参皂苷Re对照品 (批号110754-200822)、人参皂苷Rb1对照品(批号 110704-200921)、甘草酸对照品 (批号 110731-200614)，购自中国药品生物制品检定所。乙腈 (美国天地试剂公司，色谱纯，纯度≥99.9%，批号1102374)，其余试剂为分析纯。

四君子汤处方:人参9 g，白术9 g，茯苓9 g，炙甘草6 g。人参 (吉林产，批号110710)、白术 (浙江产，批号110306)、茯苓 (安徽产，批号110513)、炙甘草 (内蒙古产，批号110519)四种饮片均购自南京海源中药饮片有限公司，经南京中医药大学陈建伟教授鉴定均为正品。

2 方法与结果

2.1 人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和甘草酸的测定

2.1.1 色谱条件及系统适应性实验 Thermo Hypersil BDS色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈-0.03%甲酸，梯度洗脱，0～14 min，19%乙腈;14～15 min，20.7%乙腈;15～28 min，20.7%乙腈;28～33 min，29%乙腈;33～47 min，41%乙腈;47～52 min，41%乙腈。体积流量为0.9 mL/min;柱温30℃;人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1检测波长为202 nm，甘草酸检测波长为250 nm;进样体积20 μL。在此色谱条件下人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和甘草酸能与杂质完全分离，并取得较好的峰形和较高的理论塔板数，效果满意。

2.1.2 供试溶液的制备 精密量取50 mL四君子汤药液，置分液漏斗中，用正丁醇萃取3次，每次50 mL。合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇适量分次溶解，移置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作为供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密量取1 mL人参皂苷Rb1对照品溶液 (1.599 mg/mL)，0.5 mL人参皂苷Re对照品溶液 (1.368 mg/mL)，0.5 mL人参皂苷Rg1对照品溶液(1.522 mg/mL)，混匀即得混合标准溶液。混合标准溶液中人参皂苷Rb1为0.799 5 mg/mL，人参皂苷Re为0.342 mg/mL，人参皂苷 Rg1为0.380 5 mg/mL。甘草酸铵为0.822 4 mg/mL。

2.1.4 精密度试验 取2.1.3项下的混合对照品溶液和甘草酸铵对照品溶液，分别连续进样5次，分别对上述4种物质进行定量测定，考察精密度，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和甘草酸铵的峰面积的RSD值分别为0.61%、0.35%、0.46%、0.35%，均小于3%，说明仪器的精密度良好。

2.1.5 重复性试验 平行制备6份供试品溶液，按上述液相条件下分别对4种主要指标性成分进行定量测定，考察方法的重复性，结果人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和甘草酸的峰面积的RSD值分别0.25%、0.74%、2.66%、2.57%，均符合测定要求。

2.1.6 稳定性考察 同一供试品溶液，室温下自然放置，分别于0、2、4、8、12、24 h对4种指标性成分进行定量测定，考察样品的稳定性，结果人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷 Rb1和甘草酸的 RSD值分别为0.84%、0.62%、1.93%和0.47%，均小于3%，表明样品中人参皂苷Rg1，人参皂苷Re，人参皂苷Rb1和甘草酸的量在24 h内基本稳定。

2.1.7 加样回收试验 精密量取上述已知量的药液25 mL，共6份，分别加入一定量的对照品溶液适量，依制备供试品溶液项下制备，按上述液相色谱条件方法测定，计算加样回收率。结果表明人参皂苷Rg1的平均回收率为100.86%，RSD为2.34%;人参皂苷Re的平均回收率为100.57%，RSD为2.95%;人参皂苷Rb1的平均回收率为97.88%，RSD为2.86%;甘草酸的平均回收率为99.25%，RSD为2.97%，表明该方法测定结果准确。

2.2 汤剂相对密度和浸出物的测定相对密度和浸出物

2.2.1 汤剂浸出物的测定 精密量取25 mL药液 (相当于3.3 g原药材的质量)，置已干燥至恒定质量的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h至恒定质量，移置干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定质量，计算得膏率［10］。

2.2.2 汤剂相对密度的测定 参照《中国药典》2010年版 (一部)附录ⅦA相对密度测定法中的比重瓶法下的(2)法测定［10］。

2.3 四君子汤传统煎煮工艺影响因素的优选

2.3.1 煎煮次数的考察 称取6剂四君子汤，每剂共加20倍量的水，浸泡60 min，分别煎煮1次、2次、3次，每次煎煮60 min，每份所得药液均浓缩到250 mL。每份平行两次。汤剂中4种指标性成分测定按2.1项下方法进行，用外标两点法计算，得到上述指标性成分的质量浓度，汤剂浸出物和相对密度测定按照2.2项下进行，结果如表1。

表1 不同煎煮次数对汤剂质量的影响

结果显示，煎煮2次时，汤剂中各指标性成分较煎煮1次都明显升高;煎煮3次时，汤剂中人参皂苷Rg1反而下降;综合考虑加水量、煎煮时间及能源消耗等因素，选择煎煮2次。

2.3.2 浸泡时间的考察 称取10剂四君子汤，每剂四君子汤加20倍量的水，分别浸泡1、2、3、4、5 h，煎煮2次，每次煎煮60 min，每份所得药液均浓缩到250 mL。每份平行两次。汤剂中4种指标性成分测定按2.1项下方法进行，汤剂浸出物和相对密度测定按照2.2项下进行，测定结果如表2。

结果显示，随着浸泡时间的延长，汤剂中的主要指标性成分的质量浓度有所增加，但是到一定时间后，其增加幅度减缓。故选择2、3、4 h作为正交设计表中“浸泡时间”项下的三水平。

表2 不同浸泡时间对汤剂质量的影响

2.3.3 煎煮时间的考察 称取6剂四君子汤，每剂四君子汤加20倍量水，浸泡4 h，煎煮2次，每次分别煎煮30、60、90 min，每份所得药液均浓缩到250 mL。每份平行两次。汤剂中4种指标性成分测定按2.1项下方法进行，汤剂浸出物和相对密度测定按照2.2项下进行，结果如表3。

表3 不同煎煮时间对汤剂质量的影响

结果显示，煎煮60 min时，汤剂中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的量最高。而甘草酸的量及汤剂的浸出物和相对密度随时间延长而增加。故选择40、60、80 min作为正交设计表中“煎煮时间”项下的三水平。

2.3.4 加水量的考察 称取6剂四君子汤，每剂四君子汤分别加12、20、28倍量的水，浸泡4 h，煎煮2次，每次加水量分别为6、10、14倍量［10］，每次煎煮60 min，每份所得药液均浓缩到250 mL。每份平行两次。汤剂中4种指标性成分测定按2.1项下方法进行，汤剂浸出物和相对密度测定按照2.2项下进行，结果如表4。结果显示，不同的加水量，汤剂中的指标性成分的质量浓度及汤剂的浸出物，相对密度不同，随着加水量的增加，汤剂中的主要指标性成分的质量浓度有所增加，考虑到药液的浓缩时间，故选择16倍、20倍、24倍量水作为正交设计表中“加水量”项下的三个水平。

表4 不同加水量对汤剂质量的影响

2.4 正交设计法优选四君子汤传统煎煮工艺研究 (人参与其余药味合煎) 在确定煎煮次数为2次的基础上，以浸泡时间、煎煮时间和加水量为考察因素，结合上述四君子汤煎煮工艺影响因素研究的结果，每个因素下设定三个水平，其因素水平表见表5。

表5 因素水平

2.4.1 正交试验设计与方差分析 四君子汤质量综合评分方法:三种人参皂苷和甘草酸的加权系数分别为0.7和0.3;三种人参皂苷量总和评分=(三种人参皂苷量之和/三种人参皂苷量之和最大值)×0.7×100;甘草酸量评分=(甘草酸量/甘草酸量最大值)×0.3×100。综合评分=三种人参皂苷量综合评分+甘草酸量评分。本研究L9(33)正交实验综合评分结果见表6，方差分析结果见表7。

表6 L9(33)正交试验设计和结果

表7 四君子汤传统煎煮正交工艺方差分析

直观分析结果可知，各因素对汤剂质量的影响程度为C＞A＞B＞D，D为误差项，即影响汤剂质量的主要因素依次为加水量、浸泡时间、煎煮时间。方差分析结果可知，因素C(加水量)对汤剂质量有显著性影响，因素A(浸泡时间)和因素B(煎煮时间)对汤剂质量无影响。同时为缩短汤剂浸泡煎煮的总时间，故四君子汤煎煮工艺最佳组合A1B2C3。即取一剂量的四君子汤，加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮2次，每次60 min，合并药液。

2.5 汤剂煎煮文火与武火比较研究 按照上述优化出的工艺煎煮，比较文火和武火的差别。文火操作为一直采用文火加热煎煮。武火操作为先用武火加热煮沸，然后用用文火保持微沸状态。平行3次。汤剂中4种指标性成分测定按2.1项下方法进行，汤剂浸出物和相对密度测定按照2.2项下进行，结果如表8。

表8 不同火候对四君子汤质量的影响 (n=3)

由结果可见，先武火后文火相较于一直用文火加热煎煮，人参皂苷的量显著下降，故四君子汤煎煮应该采用一直用文火慢炖的煎煮方法。此结果与传统煎煮中补益类药物煎煮时需慢火熬炖的方法一致。

2.6 不同煎煮器具的比较研究 中药汤剂煎煮器具与汤剂质量密切相关，历代医药学家对汤剂煎煮均很重视。如陶弘景说:“温汤忌用铁器”［11］，作者分别采用不锈钢锅、砂锅和养生壶，按照优化工艺煎煮，比较三种煎煮器具对汤剂质量的影响。每种煎煮器具平行3份。汤剂中4种指标性成分测定按2.1项下方法进行，汤剂浸出物和相对密度测定按照2.2项下进行，结果如表9。

表9 不同煎煮器具对四君子汤质量的影响 (n=3)

综合上述结果可知，不锈钢锅、砂锅和养生壶对四君子汤中4种指标性成分量的煎出率高低顺序为养生壶＞砂锅＞不锈钢锅，而且不锈钢锅的煎出率明显低于养生壶和砂锅。养生壶煎出有效成分的效率最高。这可能与养生壶煎煮火候稳定有关。

2.7 四君子汤人参另煎方法研究 四君子汤中，人参另煎，加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮时间和次数见表10。其余3味药白术，茯苓，炙甘草采用2.3项下的最佳工艺，即加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮2次，每次60 min，将煎出液与人参另煎液合并。每份平行3次。汤剂中4种指标性成分测定按2.1项下方法进行，汤剂浸出物和相对密度测定按照2.2项下进行，结果如表10。

表10 不同的煎煮次数和煎煮时间对汤剂质量的影响 (n=3)

由结果可知，人参另煎煎煮2次，每次60 min，汤剂中主要指标性成分量最高。因此人参另煎的煎煮工艺为加12倍量的水，浸泡2 h，煎煮2次，每次60 min。

2.8 人参另煎与不另煎的验证比较实验 称取6剂四君子汤，分别以人参另煎与不另煎两种最佳工艺煎煮，考察人参另煎对汤剂质量的影响。平行3份。汤剂中4种指标性成分测定按2.1项下方法进行，汤剂浸出物和相对密度测定按照2.2项下进行，结果如表11。

表11 人参另煎与不另煎对汤剂质量的影响 (n=3)

由图表结果可知，人参另煎汤剂中的主要药效指标成分的量都略高于共煎液。这一实验结果验证了人参另煎这一传统煎煮方法的合理性。

综合以上结果，四君子汤传统煎煮最佳工艺为将人参置于砂锅或养生壶中，加12倍量的水浸泡2 h，用文火加热煎煮，煎煮60 min，煎煮2次。其余三味药置于砂锅或养生壶中，加12倍量的水浸泡2 h，用文火加热煎煮，煎煮60 min，煎煮2次。

3 讨论

本研究首次对比了不同煎煮器具在中药汤剂煎煮过程中对汤剂质量的影响，结果显示采用不锈钢锅、砂锅和养生壶煎煮，四君子汤煎液中4种指标性成分及汤剂的浸出物和相对密度的高低顺序为养生壶＞砂锅＞不锈钢锅，而且不锈钢锅的煎煮量明显低于养生壶和砂锅。其原因可能是不锈钢锅传热快，火力不好控制，容易将药煎糊，需要不断搅拌，且在煎煮的过程中，损失了大量的水分，导致加水量变化极大，不利于汤剂有效成分的煎出。砂锅具导热均匀、缓和，化学性质稳定，不会与中药有效成分发生化学反应，药锅保温性好等优点，且养生壶具有可控制火候的功能［12］。由实验结果可见，养生壶煎出的有效成分的量最高，故认为养生壶煎煮汤剂最好。为临床汤剂煎煮过程中，怎样正确的选择煎煮器具提供了科学依据。

本研究以四君子汤作为补益剂的代表方，比较了不同煎煮火候对中药补益剂质量的影响，结果显示先用武火后文火相较于一直用文火，人参皂苷的量显著下降，故补益类中药汤剂四君子汤煎煮应该采用一直采用文火慢炖的煎煮方法。此结果为传统煎煮中补益类药物煎煮时需慢火熬炖提供了科学参考依据。

本研究首次比较了人参另煎与不另煎对汤剂质量的影响研究，结果显示人参另煎的汤剂中主要药效指标成分的量都略高于共煎液。原因可能是因为处方中的茯苓含有大量的淀粉，随着煎煮时间的延长，其糊化程度亦随之增加，从而使煎液中的吸附和包容现象也增加，汤剂中主要指标性成分不易溶出。此结果为传统煎煮中补益类药物煎煮时需慢火熬炖提供了科学参考依据。

［1］王竹兰.《伤寒论》汤剂煎煮法与汤剂制备规范化研究［D］.北京:北京中医药大学，2010:2.

［2］李学林，李文雅.中药后下药物的分类及其煎煮方法［J］.中医研究，2010，23(1):16-17.

［3］李春来，李伟东，蔡宝昌.汤剂煎煮的规范化研究方法探讨［J］.中成药，2012，34(1):125-129.

［4］杨佃会，彭 伟.四君子汤［M］.北京:中国医药科技出版社，2009:31-32.

［5］何延良，王晓中，傅 平，等.四君子汤中化学成分的含量测定［J］.中成药，1990，12(12):43.

［6］刘 扬，杨峻山，蔡宗举.复方四君子汤水煎剂的化学研究［D］.北京:中国协和医科大学学位论文，2006:51-59.

［7］李前进.简述中药汤剂的煎煮原则及注意事项［J］.中医药导报，2010，16(7):120-121.

［8］孙彩华，钱松洋.中药汤剂的煎煮方法［J］.中国药业，2007，16(20):58-59.

［9］李军东.浅谈中药材的煎煮方法［J］.时珍国药研究，1997，8(5):479.

［10］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京:中国医药科技出版社，2010.

［11］王 抒，黄 翠.关于中药汤剂煎煮时对水量的要求［J］.中国中医药信息杂志，2009，16(1):108.

［12］廖仰平.煎煮工艺对汤剂质量的影响［J］.中国民族民间医药，2008(5):9-10.