壮药金边蚂蟥质量标准研究

陆峥琳， 黄瑞松*， 潘红平， 苏 青， 周维海

(1.广西民族医药研究院，广西南宁 530001;2.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005;3.南宁市科康生物科技有限责任公司，广西南宁 530007)

金边蚂蟥系医蛭科动物菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson的干燥全体。原动物在我国主要分布于福建、台湾、广东、广西、海南和香港［1］，广西全区各地均有分布，现广西已有人工养殖［2-4］。金边蚂蟥为广西壮医使用的药材，俗名蚂蟥、水蛭、肉钻子、马鳖、水麻贴等。壮医认为，其可调龙路，散瘀肿，用于京瑟(闭经)、呗农 (疮痈)、麻邦 (中风)、扭像(扭挫伤)等症［5］。文献记载，本品为吸血类牛蛭，主要含天然水蛭素和类组织胺合物［6-8］，其中水蛭素具有抗凝、纤溶、抑制血小板聚集、降低全血黏度、降血脂、抗血栓等作用［9-13］。目前《中国药典》尚未收入本品，该药材一直处于无标准状态中，致使该药材使用和检验无标准可依，难以控制该药材质量，影响临床用药的安全有效。为进一步开发利用金边蚂蟥资源，本实验收集了不同批次的样品，对其药材性状、TLC鉴别、水分、总灰分、酸不溶性灰分、浸出物、酸碱度、抗凝血酶活性的定量等进行研究，制订金边蚂蟥质量控制标准。

1 仪器与试药

硅胶G、H薄层板 (海洋牌，青岛海洋化工厂分厂，批号20110608;银龙牌，烟台化工研究所，批号20110412)，800型离心沉淀器 (上海手术器械厂)，1/105分析天平 (X205BDU，瑞士梅特勒公司)，雷磁PHS-3C测试仪 (上海精密科学仪器有限公司)， (牛)纤维蛋白原 (Sigma公司，F8630 9001-32-5)，凝血酶冻干粉 (河南欣泰有限公司，批号20090703)，水为蒸馏水，其余试剂均为分析纯。金边蚂蟥对照药材采自陆川县米场镇南中村，其余10批次药材采集地见表1，样品均经过广西大学动物科学技术学院潘红平教授鉴定为医蛭科动物菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson。

表1 10批金边蚂蟥产地和收集时间Tab.1 Habitats and collecting time of Poecilobdella manillensis Lesson

2 方法与结果

2.1 性状特征 见图1。呈长椭圆形、长条形，扭曲或扁平，柳叶状，长4～13 cm，体宽0.3～1.2 cm，体厚0.05～0.1 cm。背部黑色或黑褐色，有少许环节突起;腹面黑色，较光滑。前端略尖，后端钝圆，两端各具一吸盘，前吸盘不显著，后吸盘圆大。质脆，断面胶质状，黑色。气腥臭，味咸。

2.2 薄层鉴别一

2.2.1 供试品和对照药材溶液制备 取10批金边蚂蟥药材各1 g，加乙醇5 mL，超声处理15 min，滤过，取滤液作为供试品溶液;另取金边蚂蟥对照药材1 g，同上法制成对照药材溶液。

图1 金边蚂蟥药材Fig.1 Materia medica of Poecilobdella manillensis Lesson

2.2.2 薄层鉴别及结果 照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取供试品溶液2～4 μL，对照药材溶液3 μL，分别点于同一硅胶G预制板 (青岛海洋化工厂)上，以环己烷-乙酸乙酯 (4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果表明，10批供试品色谱中，日光下检视在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点;紫外光灯 (365 nm)下检视则显相同的橙色荧光斑点。本方法分离效果好，斑点集中清晰，比移值适中，重现性好。见图2、3。

图2 金边蚂蟥TLC图 (可见光色谱)Fig.2 TLC chromatogram of Poecilobdella manillensis Lesson(visible chromatography)

2.3 薄层鉴别二

2.3.1 供试品、对照药材和对照品溶液制备 取10批金边蚂蟥药材各1 g，加70%乙醇5 mL，超声处理30 min，滤过，取滤液作为供试品溶液;另取金边蚂蟥对照药材1 g，同上法制成对照药材溶液;再取亮氨酸对照品、缬氨酸对照品、丙氨酸对照品、谷氨酸对照品，加70%乙醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。

图3 金边蚂蟥TLC图 (紫外光色谱)Fig.3 TLC chromatogram of Poecilobdella manillensis Lesson(UV chromatography)

2.3.2 薄层鉴别及结果 照薄层色谱法(《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B)试验，吸取供试品溶液3～8 μL，对照药材溶液4 μL，混合对照品溶液1 μL，分别点于同一硅胶G预制板 (青岛海洋化工厂)上，以苯酚-水 (3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以茚三酮试液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果表明:10批供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，本方法分离效果好，斑点集中清晰，比移值适中，重复性好。见图4。

图4 金边蚂蟥TLC色谱图 (可见光色谱)Fig.4 TLC chromatogram of Poecilobdella manillensis Lesson(visible chromatography)

2.4 检查 水分、总灰分、酸不溶性灰分、酸碱度和醇溶性浸出物的测定分别参照2010年版《中国药典》一部附录ⅨH水分测定法第一法、IX K灰分测定法、Ⅶ G酸碱度测定法、X A醇溶性浸出物测定法中的热浸法进行。结果见表2。

表2 10批金边蚂蟥水分、总灰分、酸不溶性灰分、酸碱度及乙醇浸出物含有量的测定Tab.2 Water content，total ash，acid-insoluble ash ，pH value and alcohol-solubleextracts of Poecilobdella manillensis Lesson

2.5 抗凝血酶活性测定

2.5.1 测定方法 采用凝血酶滴定法:取金边蚂蟥药材粉末约0.5 g，精密称定，精密加入0.9%氯化钠溶液15 mL，充分搅拌，浸提45 min，并时时振摇，离心，精密量取上清液100 μL，置于小试管中，加入含0.5%纤维蛋白原 (以凝固物计)的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液 (取0.2 mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25 mL与0.1 mol/L盐酸溶液约40 mL，加水至100 mL，调节pH值至7.4)200 μL，摇匀，置水浴 (37℃ ±0.5℃)中以每分钟5 μL的速度缓缓滴加凝血酶溶液 (40单位/mL)，边滴加边轻轻摇匀，至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积，按下式计算:U=C1V1/C2V2。U为每1 g含凝血酶活性单位。中和一个单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位;C1(U/mL)为凝血酶溶液浓度;C2(g/mL)为供试品溶液质量浓度;V1(μL)为消耗凝血酶溶液的体积;V2(μL)为供试品溶液的加入量。

2.5.2 方法学考察

2.5.2.1 专属性试验 按上述测定方法，不加金边蚂蟥药材粉末制备供试液，滴加凝血酶溶液，供试液不会凝固。说明用本方法测定金边蚂蟥药材抗凝血酶活性无阴性溶剂干扰，专属性强。

2.5.2.2 精密性试验 取同一对照药材供试品溶液6份，按2.5.1项的方法分别测定。结果显示，6次测定的抗凝血酶活性平均值为269.2 U/g，RSD为0(n=6)。

2.5.2.3 重复性试验 取同一对照药材粉末6份各0.5 g，精密称定，按2.5.1项平行测定6次。结果显示，6份样品的抗凝血酶活性平均值为269.3 U/g，RSD 为0.12%(n=6)。

2.5.3 样品测定 取10批次金边蚂蟥药材，按2.5.1项方法进行测定。结果见表3。

表3 10批金边蚂蟥抗凝血酶活性测定结果 (n=2，按干燥品计)Tab.3 Results of antithrombin activity of Poecilobdella manillensis Lesson(n=2，Calculate according to drying products)

3 讨论

2010年版《中国药典》一部收载的水蛭药材为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman或柳叶蚂蟥Whitmania acranulataWhitman［14］。《中国药典》收载的水蛭都是非吸血类，其性状背部黑褐色或黑棕色，腹面棕黄色。试验所用金边蚂蟥则为吸血类，其全身均为黑褐色，与《中国药典》收载的水蛭外观性状有区别。

薄层鉴别方法一，展开剂比较了环己烷-乙酸乙酯 (4∶1)、正己烷-乙酸乙酯 (4∶1)、石油醚-三氯甲烷 (1∶1)。结果环己烷-乙酸乙酯 (4∶1)系统分离得到的斑点显色后清晰，Rf值适中。显色方式比较了3种:10%硫酸乙醇溶液显色后分别置于日光及紫外光灯 (365 nm)下观察、5%磷钼酸溶液显色后日光下观察及硫酸-醋酸酐 (1∶3)溶液显色后分别置于日光下及紫外光灯 (365 nm)下观察。结果采用10%硫酸乙醇溶液显色，主斑点显色清晰;5%磷钼酸溶液显色有背景干扰;硫酸-醋酸酐 (1∶3)溶液显色，日光下主斑点欠清晰，紫外光灯 (365 nm)下有背景干扰。

薄层鉴别方法二，展开剂比较了苯酚-水(3∶1)、正丁醇-醋酸-甲酸-水 (4 ∶1 ∶0.1 ∶1)、正丁醇-冰醋酸-水 (3∶1∶1)三种。结果以苯酚-水 (3∶1)展开较其余二者效果好，故采用之。

本实验还对TLC鉴别方法进行了耐用性试验，即对不同品牌预制板 (青岛海洋化工厂提供，批号20110608;烟台市化工研究所提供，批号20110412)、不同展开温、湿度 (温度8℃或30℃，相对湿度50%或88%)和点样方式 (点状和条带状点样)等展开效果进行考察。结果上述各种条件下的展开效果均较好，表明本方法的耐用性良好。

由表2可知，10批金边蚂蟥药材水分在7.6%～14.3%，平均水分为10.2%。考虑到该药材为南方所产，而南方气候较为湿润，药材在运输和贮存过程中发生变化等因素，因此，将本品水分拟订为不得过15.0%。10批样品的总灰分为1.7%～3.8%，平均值为2.5%;酸不溶性灰分为0.1%～0.3%，平均值为0.2%;pH值为5.9～7.3，平均值为6.7;醇溶性浸出物含有量为9.4%～21.7%，平均值为16.0%。因此将本品总灰分拟定为不得过6.0%，酸不溶性灰分为不得过0.5%，pH值为5.5～7.5，浸出物含有量为不少于8.0%。

金边蚂蟥主要含天然水蛭素和类组织胺［6-8］，其中水蛭素具有抗凝、纤溶、抑制血小板聚集、降低全血黏度、降血脂、抗血栓等作用［9-13］，是该药材的主要有效成分，故本实验研究制订了抗凝血酶活性的定量测定方法。该方法中有关样品供试液制备，采用正交试验方法，对样品不同取样量、不同提取时间、氯化钠溶液不同加入量等三因素进行考察，每个因素设定三水平，采用L9(34)正交表进行试验，考察指标为每1 g药材所含抗凝血酶活性单位。根据试验结果确定供试液制备方法如2.5.1项。文献报道，宽体金线蛭Whitmania pigraWhitman、日本医蛭Hirudo nipponicaWhitman和菲牛蛭Poecilobdella manillensisLesson均有不同程度的抗凝血酶活性，采用冷浸和温浸提取，抗凝血酶活性大小为菲牛蛭＞日本医蛭＞宽体金线蛭［15］。由表3可知，10批金边蚂蟥药材抗凝血酶活性为244.8～298.7 U/g，平均含有量为267.2 U/g。该结果较文献报道的数据高，考虑到药材来源的差异，限度拟定为:本品每1 g含抗凝血酶活性应不低于220.0 U(按干燥品计)。

本研究制订的金边蚂蟥药材质量控制方法，现已收入《广西壮族自治区壮药质量标准》第二卷(2011年版)［5］，对控制该药材质量有着积极的作用。

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