红花清肝十三味丸质量标准研究

刘 颖， 胡 琴*， 史文凤

(1.北京市药品检验所，北京 100035;2.长治医学院，山西长治 046000)

红花清肝十三味丸来源于《蒙医验方》，1984年收载入《内蒙古蒙成药标准》，2001年收载入《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册)。原标准收载了显微鉴别以及两个理化鉴别［1］。为控制药品的内在质量，对处方中红花、丁香、木香、诃子、栀子、紫檀香、人工牛黄进行了薄层色谱鉴别，并采用高效液相色谱法测定了制剂中栀子苷、羟基红花黄色素A、丁香酚。所建立的方法具有操作简便、分离效果好、重复性好，专属性强，准确等优点，可以有效地控制本品的质量。

1 仪器与试药

岛津LC—20A高效液相色谱仪，配备二极管阵列检测器 (PDA)型;聚酰胺薄膜 (浙江省台州路桥四甲生化塑料厂);硅胶G预制板 (烟台市化学工业研究所);硅胶G预制板 (青岛海洋化工厂分厂)。

对照品:羟基红花黄色素A(批号111637-200502)、丁香酚 (批号725-200209)、去氢木香内酯 (批号:111525-200706)、木香烃内酯 (批号:111524-200503)、没食子酸 (批号:110831-200803)、栀子苷 (批号:110749-200714)、胆酸(批号:100078-200414)、猪去氧胆酸 (批号100087-200610)。对照药材:红花 (批号120907-200609)、丁香 (批号121039-200503)，木香 (批号120921-200607)、诃子 (批号121015-200503)。对照品与对照药材均购于中国食品药品检定研究院。

红花清肝十三味丸样品共11批:A(批号:20120203);B(批号:110525 071，110526 027);C(批 号:10455001，10455002);D(批 号:110825，110420，110419);E(批 号:110925，111056，110946)。

甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 薄层色谱鉴别

2.1 红花及羟基红花黄色素A的薄层鉴别

取本品3 g，研细，加甲醇10 mL，超声处理30 min，静置，取上清液作为供试品溶液。另取不含红花的阴性制剂，同法制成红花阴性溶液。另取红花对照药材1 g，加甲醇5 mL，超声处理10 min素A对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液及红花阴性溶液5 μL，对照药材溶液 2 μL，对照品溶液 1 μL，点于聚酰胺薄膜上，以醋酸展开，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯 (365 nm)下检视。供试品在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。缺红花阴性样品无相应斑点。见图1。

图1 红花清肝十三味丸中红花及羟基红花黄色素A的TLC图谱Fig.1 TLC chromatogram of Carthami Flos and hydroxysafflor yellow A

2.2 丁香及丁香酚、木香及去氢木香内酯的薄层色谱鉴别［2-4］

分别取不含丁香、木香的阴性制剂各3 g，研细，加甲醇10 mL，超声处理30 min，静置，取上清液，分别作为丁香阴性溶液及木香阴性溶液。另取丁香对照药材、木香对照药材各1 g，分别加甲醇5 mL，超声处理10 min，静置，取上清液作为对照药材溶液。再取丁香酚对照品、去氢木香内酯对照品，分别加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取2.1项下供试品溶液，丁香阴性溶液、木香阴性溶液及两种对照药材溶液各10 μL，两种对照品溶液各5 μL，点于硅胶 G板上，以环己烷-甲酸乙酯-甲酸 (15∶5∶1)展开，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺丁香及缺木香阴性样品无相应斑点。见图2。

2.3 诃子及没食子酸的薄层色谱鉴别

图2 红花清肝十三味丸中丁香、丁香酚、木香、去氢木香内酯的TLC图谱Fig.2 TLC chromatogram of Caryophylli Flos，eugenol，Aucklandiae Radix，dehydrocostuslactone

取不含诃子的阴性制剂3 g，研细，加甲醇10 mL，超声处理30 min，静置，取上清液，作为诃子阴性溶液。另取诃子对照药材1 g，加甲醇5 mL，超声处理10 min，静置，取上清液作为对照药材溶液。再取没食子酸对照品1 mg，用1 mL甲醇溶解，作为对照品溶液。吸取2.1项下供试品溶液、诃子阴性溶液及对照药材溶液各10 μL，对照品溶液3 μL，点于硅胶G板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 (5∶4∶1)展开，喷以2%三氯化铁乙醇液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺诃子阴性样品无相应斑点。见图3。

2.4 栀子苷的薄层色谱鉴别

取不含栀子的阴性制剂3 g，研细，加甲醇10 mL，超声处理30 min，静置，取上清液，作为栀子阴性溶液。另取栀子苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取2.1项下供试品溶液、栀子阴性溶液各10 μL，对照品溶液2 μL，点于硅胶G板上，以乙酸乙酯-丙酮-水(6∶6∶1)展开，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺栀子阴性样品无相应斑点。见图4。

2.5 紫檀香的薄层色谱鉴别［5-7］

图3 红花清肝十三味丸中诃子及没食子酸的TLC图谱Fig.3 TLC chromatogram of Chebulae Fructus and gallic acid

图4 红花清肝十三味丸中栀子苷的TLC图谱Fig.4 TLC chromatogram of geniposide

取不含紫檀香的阴性制剂3 g，研细，加甲醇10 mL，超声处理30 min，静置，取上清液，作为紫檀香阴性溶液。另取紫檀香对照药材1 g，加甲醇5 mL，超声处理10 min，静置，取上清液作为对照药材溶液。吸取2.1项下供试品溶液、紫檀香阴性溶液各10 μL，对照药材溶液3 μL，点于硅胶G板上，以甲苯-丙酮 (7∶3)展开，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。缺紫檀香阴性样品无相应斑点。见图5。

2.6 胆酸、猪去氧胆酸的薄层鉴别

取不含人工牛黄的阴性制剂3 g，研细，加甲醇10 mL，超声处理30 min，静置，取上清液，作为人工牛黄阴性溶液。另取胆酸对照品、猪去氧胆酸对照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取2.1项下供试品溶液、人工牛黄阴性溶液各10 μL，对照品溶液2 μL，点于硅胶 G板上，以异辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸(15∶7∶5)展开，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外灯 (365 nm)下检视。供试品在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。缺人工牛黄阴性样品无相应斑点。见图6。

图5 红花清肝十三味丸中紫檀香的TLC图谱Fig.5 TLC chromatogram of Pterocarpi indici Lignum

图6 红花清肝十三味丸中胆酸、猪去氧胆酸的TLC图谱Fig.6 TLC chromatogram of cholic acid and hyodeoxycholic acid

3 HPLC法测定栀子中栀子苷、红花中羟基红花黄色素A、丁香中丁香酚［8-9］

3.1 色谱条件 Phenomenex Luna C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱。柱温为30℃，检测波长分别为栀子苷238 nm，羟基红花黄色素A 403 nm，丁香酚280 nm。理论板数按理论板数按栀子苷峰、羟基红花黄色素A峰、丁香酚峰计算均应不低于3 000。

表1 梯度洗脱流动相比例Tab.1 Gradient elution ratio using methanol-H2O

3.2 对照品溶液的制备 取栀子苷对照品、羟基红花黄色素A对照品和丁香酚对照品适量，精密称定，分别加70%甲醇制成每1 mL含栀子苷20 μg，羟基红花黄色素 A 25 μg，丁香酚40 μg的溶液，即得。

3.3 供试品溶液的制备 取本品，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，称定质量，加热回流60 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.4 阴性样品溶液的制备 分别按处方比例及制剂制备工艺制备不含栀子、红花、丁香的阴性样品，再按3.3项下方法制备，即得。

3.5 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪测定，结果红花、丁香、栀子阴性样品分别在羟基红花黄色素A、丁香酚、栀子苷相应保留时间处未见色谱峰，表明阴性样品对检测无干扰。见图7～9。

3.6 线性关系考察 分别精密吸取栀子苷对照品溶液 (质量浓度为 0.106 5 mg/mL)1、6、12、15、18、21 μL;羟基红花黄色素 A对照品溶液(质量浓度为 0.064 66 mg/mL)1、3、5、6、8、9、12 μL;丁香酚对照品溶液 (质量浓度为0.227 8 mg/mL)1、5、9、15、18、21 μL，注入高效液相色谱仪，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，其回归方程:栀子苷为y=1 444 967.883 12x－8 515.467 88(r=1.000 0)，表明其在0.106 5～2.236 5 μg范围内线性关系良好;羟基红花黄色素A为y=2 913 887.269 01x－25 106.472 60(r=0.999 8)，表明其在0.064 66 ～0.775 92 μg范围内线性关系良好;丁香酚为y=973 750.233 23x+5 538.847 34(r=1.000 0)，表明其在0.227 8～4.783 8 μg范围内线性关系良好。

3.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液 (批号:20120203)，按3.1项，分别在制备后0、4、8、16、20、24 h进样测定。结果峰面积RSD栀子苷为0.54%，羟基红花黄色素A为2.2%，丁香酚为0.73%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

3.8 重复性试验 取本品，研细，取约1 g，精密称定，依法测定。结果栀子苷RSD为0.73%;羟基红花黄色素A RSD为1.95%;丁香酚RSD为1.2%，方法重复性良好。

图7 栀子苷测定HPLC图谱Tab.7 HPLC chromatograms of geniposide

图8 羟基红花黄色素A测定HPLC图谱Fig.8 HPLC chromatogramsofhydroxysafflor yellow A

图9 丁香酚测定HPLC图谱Fig.9 HPLC chromatograms of eugenol

3.9 加样回收率试验 精密称取已知含有量的同一批样品 (批号20120203，栀子苷含有量为3.881 8 mg/g，羟基红花黄色素A含有量为3.026 4 mg/g，丁香酚含有量为7.857 0 mg/g)。①低浓度:取约0.25 g精密加入对照品混合溶液 (含栀子苷0.019 915 mg/mL，羟基红花黄色素A 0.01056mg/mL，丁香酚0.02380 mg/mL)50 mL;②中浓度:取约0.5 g精密加入对照品混合溶液 (含栀子苷0.039 83 mg/mL，羟基红花黄色素 A 0.021 12 mg/mL，丁香酚0.047 60 mg/mL)50 mL;③高浓度:取约1 g精密加入对照品混合溶液 (含栀子苷0.079 66 mg/mL，羟基红花黄色素 A 0.042 24 mg/mL，丁香酚0.095 20 mg/mL)50 mL，按供试品溶液同法制备，测定。结果栀子苷平均回收率97.24%，RSD为1.2%;羟基红花黄色素A平均回收率96.75%，RSD为2.0%;丁香酚平均回收率98.56%，RSD为1.8%。见表2～4。

3.10 样品测定 按上述测定方法，测定11批红花清肝十三味丸样品，结果见表5。

表2 栀子苷加样回收试验Tab.2 Results of recovety tests of geniposide

表3 羟基红花黄色素A加样回收试验Tab.3 Results of recovery tests of hydroxysafflor yellow A

表4 丁香酚加样回收试验Tab.4 Results of recovery tests of eugenol

4 讨论

丁香、丁香酚、木香、去氢木香内酯的薄层鉴别中，曾对木香烃内酯薄层色谱进行了研究，但在其色谱相应位置上，有时空白会有干扰，故仅以木香药材及去氢木香内酯作为对照。

表5 栀子苷、羟基红花黄色素A、丁香酚测定结果(n=3)Tab.5 Determination results of geniposide，hydroxysafflor yellow A，eugenol(n=3)

栀子苷的薄层鉴别中，曾对栀子对照药材薄层色谱进行了研究，通过样品、栀子苷对照品、栀子对照药材及空白各色谱的比较，认为栀子的主要鉴别成分为栀子苷，故仅以栀子苷作为对照。

丁香中丁香酚的定量测定采用《中国药典》2010年版GC的方法，本研究为达到在操作简便的基础上得到更多可靠数据的目的，采用了HPLC方法测定丁香酚的量，其最大吸收波长除参考文献［10-12］外，还采用了PDA检测器扫描验证，确定其最大吸收波长为280 nm。

本实验分别采用不同品牌色谱柱Phenomenex luna C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，TechMate C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm)，Kromasil 100-5C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)进行测定，结果羟基红花黄色素A、丁香酚、栀子苷峰分别在各种色谱柱均分离良好，空白无干扰，不同色谱柱间测定羟基红花黄色素A的RSD为1.2%，丁香酚的RSD为2.3%，栀子苷的RSD为2.3%，表明本HPLC方法有较好的耐用性。

根据表5的数据分析，栀子苷含有量数据各厂家、各批次及RSD值差异均较小;羟基红花黄色素A的含有量测定数据，各厂家之间相差较大，其中厂家C未测出羟基红花黄色素A，经与企业联系，认为与其灭菌方法有关，该成分不稳定，不宜采用加热灭菌的方法;丁香酚含有量测定数据，各厂家、各批次均有一定差异，由于丁香酚为易挥发性成分，有可能与原料、生产、贮藏、运输等环节有关。除栀子苷、羟基红花黄色素A、丁香酚3成分外，还对没食子酸、木香烃内酯、去氢木香内酯进行了研究。但在与没食子酸相应保留时间处诃子阴性对照有干扰，木香中木香烃内酯、去氢木香内酯峰形均欠佳，故未对这3种成分进一步进行定量测定研究。

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