厄贝沙坦预处理对心肌缺血再灌注损伤的影响

徐敬娟，赵凤琴

辽宁医学院，辽宁锦州 121001

随着冠状动脉内溶栓、经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)等方法的广泛应用，再灌注治疗成为急性冠脉综合征的重要治疗方法，与此同时再灌注损伤成为一大研究热点。肾素-血管紧张肽-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在缺血再灌注损伤中起重要作用。国内外已有许多实验证实，血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI)对心肌缺血再灌注具有保护作用。本研究通过制备大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，观察血管紧张肽Ⅱ1型受体阻断剂厄贝沙坦对缺血再灌注损伤中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)的影响及对梗死面积、心肌形态结构的影响，以探讨在心肌缺血再灌注过程中，血管紧张肽Ⅱ1型受体阻断剂厄贝沙坦对心肌保护作用的可能机制。

材料和方法

1 实验动物和分组 健康成年雄性SD大鼠38只，体质量250~300 g，由辽宁医学院实验动物中心提供，分笼饲养，自由饮水。随机分成3组，假手术组6只(0.9%氯化钠注射液2 ml/d)、缺血再灌注(I/R)组16只(0.9%氯化钠注射液2 ml/d)、厄贝沙坦组16只(厄贝沙坦30 mg/(kg·d))，每天中午灌胃，预处理1周。假手术组开胸穿线不结扎冠脉，其余两组通过结扎左室前降支45 min，松开结扎在灌注120 min建立缺血再灌注模型。

2 试剂和仪器 厄贝沙坦由修正药业有限公司提供；丙二醛(MDA)试剂盒肌钙蛋白(troponin I，TNI)试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；ELISA IL-6试剂盒和TNF-α试剂盒由美国R﹠D公司提供。小型动物呼吸机，小型动物心电图机，p6分光光度计，酶标仪，显微镜，高速台式离心机(美国Sigma公司)37℃恒温水浴箱。

3 大鼠在体心肌I/R模型的建立 大鼠用20%乌拉坦(5 ml/kg)行腹腔麻醉后，接心电监护仪检测心电变化，气管切开插管进行呼吸机辅助呼吸(频率60/min，潮气量20 ml/kg)。于胸骨左旁3~4肋间行纵行切口，剪断肋骨，破胸膜、心包膜，与冠状动脉左前降支0.2~0.3 cm处，用4.0Prolene线穿过动脉，除对照组仅穿线不结扎外，其余两组用一细小带凹槽乳胶管垫于血管与结扎线之间，结扎45 min后沿凹槽剪断结扎线，复灌120 min。结扎成功标准[1]：结扎线远端心肌颜色发绀，心电图表现QRS增高增宽，ST段抬高。再灌注成功标准：缺血部位心肌颜色恢复，以标准Ⅱ导联抬高的ST段下降50%以上。

4 心肌组织病理学观察 将心肌置于10%甲醛溶液中固定，石蜡包埋后常规切片，HE染色，光镜下观察病理变化。

5 血清IL-6、TNF-α含量检测 大鼠造模成功后，每组随机取10只，用注射器在右心房取血2 ml，3 000 r/min离心10 min，分离血清，分成两份，-80℃冰箱保存，待所有样本收集完后，根据IL-6、TNF-α ELISA试剂盒说明书，检测血清IL-6、TNF-α含量。

6 MDA、TNI含量检测 按以上方法取血清后，按照说明书加试剂，用p6分光光度计检测吸光度，根据公式计算血清MDA含量。血清中MDA含量=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(10nmol/ml)肌钙蛋白由生化全自动分析仪测定。肌钙蛋白由生化全自动分析仪测定。

7 心肌梗死面积测定[2-3]除假手术组外，每组剩余6只大鼠再灌注后，重新结扎冠状动脉左前降支，经尾静脉将2% Evans blue 1ml注入，待大鼠口唇发蓝后，迅速取下心脏，0.9%冰氯化钠注射液清洗，剪去心房和右心室，滤纸吸干表面水分，置-20℃冷冻30 min，沿长轴切成2 mm的薄片5张，将切片浸入5% TTC的磷酸缓冲液中(pH 7.4)37℃孵育30 min，以区分缺血未梗死区(浅红色)和梗死区(灰白色)，10%甲醛固定24 h，蓝色为正常心肌，浅红色为缺血未梗死心肌，灰白色为梗死心肌。用计算机图像分析软件Image-Pro Plus 3.0计算梗死面积占左心室面积的百分比。

8 统计学方法 所有数据采用SPSS13.0统计软件进行处理。实验数据以表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 HE染色光镜观察(×400) A： 假手术组； B： 缺血再灌注组； C： 厄贝沙坦组Fig.1 Inflammatory cell infiltration(HE×400) in sham group(A), I/R group(B) and irbesartan treatment group(C)

表1 各组大鼠血清MDA、IL-6、TNF-α、TNI浓度及梗死面积的比较Tab.1 Serum MDA, IL-6, TNF-α, TNI concentrations and infarction area in different groups(

表1 各组大鼠血清MDA、IL-6、TNF-α、TNI浓度及梗死面积的比较Tab.1 Serum MDA, IL-6, TNF-α, TNI concentrations and infarction area in different groups(

aP＜0.01, vs group A; bP＜0.01, vs group B

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结 果

1 大鼠心肌组织病理形态变化 假手术组：心肌结构正常，心肌纤维排列整齐，无水肿、无炎细胞浸润(图1A)；缺血再灌注组：大范围心肌纤维变性、断裂，细胞核碎裂、溶解甚至消失，细胞空泡变性，细胞间质高度水肿，明显充血，中度炎性细胞浸润(图1B)；厄贝沙坦组：心肌纤维排列基本正常，可见少量细胞核碎裂与溶解，细胞间质轻度水肿，少量炎细胞浸润(图1C)。见图1。

2 厄贝沙坦预处理对大鼠相关指标的影响 缺血再灌注组和厄贝沙坦预处理组血清MDA、IL-6、TNF-α明显高于假手术组(P＜0.01)；厄贝沙坦预处理组明显低于缺血再灌注组(P＜0.01)。缺血再灌注组和厄贝沙坦预处理组肌钙蛋白明显增高，厄贝沙坦组肌钙蛋白低于缺血再灌注组(P＜0.01)。与缺血再灌注组比较厄贝沙坦预处理能够明显减少心肌梗死面积(P＜0.01)。见表1。

讨 论

血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(angiotensinⅡreceptor blockers，ARBs)广泛应用于高血压、心室重构的治疗，近年应用于心肌梗死后的治疗越来越多，有报道称能减少再灌注心律失常的发生，降低心肌梗死病死率，对心肌缺血再灌注具有保护作用。

缺血再灌注后心肌组织的炎性反应被证明是再灌注损伤的重要机制[4]。缺血再灌注组与假手术组比较，缺血再灌注120 min后，血清炎性因子IL-6、TNF-α明显升高(P＜0.01)，说明炎症因子IL-6、TNF-α参与了心肌缺血再灌注损伤，与文献报道一致。再灌注后心肌细胞损伤严重，且炎性细胞大量积聚，可能激活了炎性细胞如中性粒细胞、单核细胞等合成并释放大量的炎性因子[5](IL-6、TNF-α)，这些炎症递质的升高又刺激中性粒细胞及心肌细胞表面黏附分子(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的表达，诱导中性粒细胞黏附穿过内皮迁移至心肌缺血部位，造成对缺血部位炎细胞的浸润及损伤，中性粒细胞可阻塞毛细血管，使心肌微循环的损伤程度加重[6]，增大梗死面积。IL-6、TNF-α主要由单核巨噬细胞、T细胞、B细胞以及内皮细胞产生的一种具有多种生物活性的细胞因子，其水平与缺血后及再灌注后的损伤程度相关[7]，研究证明炎性因子(IL-6、TNF-α)的增加是心肌对损伤的一种应激反应，可诱导心肌细胞凋亡，增加心肌梗死面积。Neri Serneri等[8]报道雷米普利可显著减少再灌注心肌TNF-α表达水平，与本实验结果相符。

厄贝沙坦预处理组与缺血再灌注组比较，血清炎性因子IL-6、TNF-α显著降低(P＜0.01)。损伤较缺血再灌注组明显减轻，可能是由于厄贝沙坦减少了炎症因子的合成和释放，降低了炎症因子引起中性粒细胞迁移浸润，一定程度上阻止了恶性循环引起心肌细胞结构的破坏。减轻炎症反应可减少微栓子阻塞、心肌细胞水肿、血管内皮损伤及心肌梗死面积。厄贝沙坦预处理可以在一定范围内提高机体的免疫功能，维持细胞膜的稳定性，对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用。有研究报道[9]血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)预处理后可使血清IL-6、TNF-α明显减少，减轻心肌再灌注损伤。炎症在心肌缺血再灌注损伤中起重要作用[10-11]。还有实验研究显示替米沙坦能通过直接抑制脂肪细胞促炎因子的生成而发挥抗炎作用[12]。

氧化应激也是心肌缺血再灌注损伤的主要机制之一[13]，MDA是氧自由基引发脂质过氧化反应的产物，其含量反映氧自由基水平和脂质过氧化的强度和速度，是了解氧自由基致机体组织损伤的重要指标之一。本实验表明，厄贝沙坦能抑制脂质过氧化过程，减轻氧自由基对心肌的损伤。许多针对不同心血管疾病状态的临床研究都表明阻断RAS可以减少炎症作用和氧化应激，这可能是降低心血管意外的重要因素[14]。

厄贝沙坦预处理后，肌钙蛋白(TNI)降低，说明心肌细胞损伤较轻。TNI存在心肌中，心肌细胞坏死后释放入血，是临床上检测心肌梗死的重要生化指标。表明厄贝沙坦预处理可减少坏死心肌细胞和(或)对心肌细胞膜的通透性有保护作用。厄贝沙坦对心肌的保护作用可能有以下原因：1)当心肌梗死时，RAS系统被激活，产生大量的血管紧张素Ⅱ通过AT1受体导致细胞内Ca2+超载、血管内皮细胞损伤和中性粒细胞的激活，从而加重缺血再灌注心肌的损伤，厄贝沙坦可阻断此作用，还可降低AT1受体的表达。2)加用厄贝沙坦阻断AT1受体，导致血浆中增高血管紧张素II升高与AT2结合进而激活缓激肽-NO途径，增加心肌局部NO浓度[15]，扩张冠状动脉、改善内皮细胞功能、抑制血小板和白细胞在内皮细胞黏附和聚集，减轻心肌损伤，减少梗死面积。3)此外，本实验研究，炎症反应在心肌再灌注损伤中起重要作用，厄贝沙坦可减少炎症因子的合成或释放，抑制炎症反应，减少脂质过氧化，从而减轻心肌细胞的损伤。

总之，心肌缺血再灌注损伤的机制繁多且复杂，厄贝沙坦对心肌缺血再灌注有一定的保护作用，能减轻氧自由基的损伤，降低炎症因子的合成和释放，这可能是它减轻再灌注损伤的一个重要途径，其确切机制需待进一步研究。

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