转染慢性粒细胞白血病总RNA对树突状细胞介导的抗白血病作用的体外研究

饶燕飞 ，邹湉 ，杨桂玲 ，王小中 ，丁伟荣

(1、南昌大学第二附属医院检验科，江西 南昌 330006；2、南昌大学第二附属医院血液科，江西省血液病研究所，江西 南昌 330006；3、江西省人民医院，江西 南昌 330006)

慢性粒细胞白血病 (chronic myelocytic leukemia，CML)是一种克隆性骨髓增殖异常性疾病，其特征是存在特异性Ph1染色体，形成bcr-abl融合基因，编码异常的融合蛋白P210，P210具有酪氨酸激酶活性，导致CML发生。迄今治愈CML的最有效方法是异基因造血干细胞移植(allogenenic stem cell transplantation，Allo-SCT)，然而由于受干细胞来源及患者年龄等诸多因素限制，仅有少部分患者能进行该方法治疗。目前，人们越来越重视免疫治疗，特别是T细胞介导的特异性免疫效应在CML治疗中的作用。异基因T细胞对Allo-SCT后CML复发能产生强力的保护作用；给Allo-SCT后CML复发患者输注同一供者的淋巴细胞，可诱导疾病的再次缓解，这是细胞免疫介导的移植物抗白血病(graft versus leukemia，GVL)作用的最直接证据，诱导和提高特异性T细胞免疫反应是根治CML的方向之一。

近年来研究发现，CML细胞体外诱导可生成树突状细胞(DC)，称之为慢性粒细胞白血病-树突状细胞(CML-DC)。由于这种DC来源于白血病细胞，自身带有白血病抗原，而且又是抗原提呈细胞(APC)，因来自患者本身，不存在组织相容性复合物(MHC)限制，若其免疫功能得到肯定，它就有可能在白血病免疫治疗方面开辟崭新的领域。但有研究表明，未成熟白血病源性DC胞饮能力低以及成熟白血病源性DC功能有一定缺陷，其表面的CD80、CD83、CD86、MHCⅠ类和 MHCⅡ类分子表达减少[1]。本研究体外诱导培养CML-DC，观察其形态、免疫表型、白血病源性及其所诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。同时研究观察人CML总RNA体外转染对CML-DC抗原递呈功能的影响，以探讨RNA抗原负载DC疫苗体外制备的有效性。

1 材料与方法

1.1 标本来源 标本来源于我院2006年2月至2007年8月初治未经化疗CML患者14例 (慢性期)，男9例，女 5例。年龄22～70岁。Ph1染色体和bcr-abl融合基因均阳性。诊断及分期标准见参考文献[2]。

1.2 主要试剂 RPMI 1640培养基为GIBCOBRL公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma公司产品；DMSO购自上海华美生物工程公司；重组人粒单核细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白细胞介素 4(rhIL-4)、肿瘤坏死因子 α(TNF-α)均购于Peprotech公司；CD83、CD1α单抗购于Caltag公司。Trizol试剂、鼠白血病病毒逆转录酶 (MMLV)购自Gibco/BRL公司。Tag DNA聚合酶购自Sangon公司。

1.3 方法

1.3.1 慢性粒细胞白血病来源的树突状细胞的培养 参考文献[3]，无菌采集CML患者骨髓液5ml，肝素抗凝，经淋巴细胞分离液梯度离心后，取界面层的单个核细胞(MNC)，用PBS洗涤3次，加入含体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640培养液，调整细胞浓度为1×106/L，加入6孔板，每孔3ml，每孔 中 加 入 GM-CSF 100ng/ml，IL-4 100ng/ml， 于37℃、体积分数为5% 的CO2培养箱中培养，3～4d半量换液及添加细胞因子，并用倒置显微镜进行形态学观察及摄片。培养第7d，每孔第7d加入TNF-α10ng/ml，第14d收集细胞作为实验用细胞。培养液中不添加细胞因子、培养相同数量和时间的AML-MNC作为对照。将培养前后细胞送流式细胞仪检测CD1a、CD83表达率。

1.3.2 免疫表型检测 取培养14d后的细胞悬液，用PBS洗涤液调整细胞浓度为2×106/ml，分别加入鼠抗人单抗CD83-FITC和CD1α-PE标记30min，洗涤后用流式细胞仪检测阳性细胞比率，用EPICSXL systemⅡ软件分析。以同型IgG-FITC作阴性对照。

1.3.3 慢性粒细胞白血病来源的树突状细胞Ph1染色体检查 将培养成熟的CML-DC经秋水仙碱处理停滞于细胞分裂中期，收集细胞后经预固定、第一、二次固定后置于冰处理玻片上制片，75~80℃2h，以 37℃、pH7.0~7.2，0.25%的胰蛋白酶溶液消化大约10min，以10%Giemsa液染色15~20min，自来水漂洗待干后镜检与照相。

1.3.4 CML成熟树突状细胞bcr-abl融合基因的巢式RT-PCR检测 按照Trizol说明书将CML-DCs抽提出总RNA，以核酸蛋白分析仪测得总RNA的浓 度 及 A260、A280数 值 ，AMV Reverse Transcriptase逆转录合成cDNA。第1轮PCR引物：A：5’-CTC CAG ACT GTC CAC AGC ATT CCG-3’；B:5’-CAG ACC CTG AGG CTC AAA GTC AGA-3’；第 2轮 PCR 引物：C:5’-GCT TCT CCC TGA CAT CAT CCG TG-3’； D:5’-CGA GCG GCT TCA CTC AGA CC-3’。94℃5min 变性，94℃45s，55℃60s，72℃90s，30个循环，70℃延伸7min。内参照基因为βactin基因，扩增片段长度528bp。取第2轮PCR产物及Marker各5μl，在100V电压条件下电泳约30min，于凝胶成像系统观察结果，拍照和分析结果。

1.3.5 慢性粒细胞白血病总RNA转染CML-DC DCs培养第5d，于转染前2h，使用无血清培养基RPMI1640洗细胞3次，以无血清培养基调至1×106/ml待用，并分为三组：实验1组，按照操作说明书将CML细胞总RNA和脂质体的混和物加至DC培养板，比例为10μg总RNA/106DCs，并在 37℃，5%CO2培养箱中孵育，4h后吸出上清，按照DC培养方法继续培养，记为总RNA脂质体转染CMLDC组；实验2组，将CML细胞总RNA直接加至DC培养板， 比例为 10μg总 RNA/106DCs，在37℃，5%CO2培养箱中孵育，4h后吸出上清，按照DC培养方法继续培养，记为裸总RNA转染 CMLDC组；实验3组，加入脂质体至DC培养板，继续培养DC，记为单纯CML-DC组。共获得三种CML-DC细胞，用于下面的MTT法测定CTL细胞对靶细胞的杀伤效果试验。

1.3.6 MTT法测定CTL细胞对靶细胞的杀伤效果抽取患者外周血5ml，经淋巴细胞分离液提取出MNC，以1×107/ml密度种入培养瓶，2h贴壁后选取悬浮细胞，以5×106/ml种入培养瓶，加入IL-2(终浓度为100ng/ml)，隔天换液，培养至第7d分别与上述三种成熟CML-DC按照3：1的比例混合，以IL-2 100ng/ml，隔天换液继续培养7d，分离去除CML-DC细胞，获得三种CTL效应细胞。对照组为单纯IL-2培养的T淋巴细胞。另取液氮保存的CML BMMNC加培养液、自体血清和rhGM-CSF，在37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养72h，以进入对数生长期的细胞作为靶细胞。按效应细胞：靶细胞20：1加入96孔培养板，效应细胞孔每孔加入1×106个淋巴细胞，靶细胞孔每孔加入5×104个靶细胞，每组3个复孔，另设一组孔只加培养液作为对照，作用 24h后，每孔加入 MTT20μl，在 37℃、5%CO2，饱和湿度条件下培养4h，离心，去除孔内培养液，每孔加入DMSO，振荡使结晶物溶解，在酶标仪波长为570nm下读取A值。重复3次。计算公式如下：CTL活性 (%)＝(靶细胞孔A值-实验孔A值+效应细胞孔A值)/靶细胞孔A值×100%。

1.3.7 统计学分析 计量资料用x±s表示，两组间均数比较采用两样本t检验，使用SPSS13.0软件分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 培养的CML-DC细胞形态学的改变观察 刚分离的细胞表面光滑，大小均匀的球形细胞；第3d开始见细胞增殖成簇，聚团生长，悬浮状，细胞表面出现少量小突；培养至第8d(加入TNF-α后1d)，细胞表面很快出现较多具有毛刺形状，形态不规则的DC；培养至第14d，细胞具有大量毛刺，呈半悬浮状态，成为具有典型形态的DC。

2.2 CML-DC培养前后免疫表型的变化 培养前CML骨髓单个核细胞CD1a、CD83表达率分别为4.22±1.03%、1.44±0.94%，培养后成熟 CML-DC 表达率明显增高，分别为 20.13±3.43%、26.76±2.79%，差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.3 成熟树突状细胞CML源性检测 CML BMMNC诱导出的DC经G显带分析均具有t(9;22)染色体易位，即Ph1染色体。并且经巢式RT-PCR检测可见165bp和90bp两种片断。而bcr-abl融合基因有b3a2和b2a2两种形式，其中b3a2表达产物为165bp，b2a2表达产物为90bp，因此可见两种片断，也证明了树突状细胞的白血病源性。见图1。

图1 慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞诱导出的树突状细胞bcr-abl融合基因检测结果。

2.5 慢性粒细胞白血病骨髓单个核细胞总RNA的的质量检测 1×107个肿瘤细胞，经核酸蛋白分析仪检测，可获得80～120μg总RNA，经凝胶电泳，可见18S、28S两条清楚的带，证明总RNA未降解。测得A260/A280的比值均在1.8~2.0之间，说明提取的RNA纯度较好。

2.6 MTT法测定CTL细胞对靶细胞的杀伤效果实验各组DC按照3：1的比例与T淋巴细胞混合，生成的CTL活性测定结果显示：总RNA脂质体转染CML-DC组、裸总RNA转染CML-DC组和单纯DC组的CTL在效：靶比为20：1时，对CML骨髓单个核细胞的杀伤效率分别为75.33±3.11%、37.23±2.92%、29.62±1.61%， 均明显高于对照组(9.87±3.43%，P<0.01)。总 RNA 脂质体转 染的CML-DC组的CTL杀伤活性最强，与其他三组杀伤活性均有显著性差异(P<0.001)。单纯DC的CTL组明显高于经IL-2培养的对照组，差异具有统计学意义(P<0.001)。

3 讨论

近年来，人们对CML免疫治疗越来越感兴趣，由于CML同时具备诱发主动免疫的两大特性，即既具备肿瘤特异性抗原P210蛋白，又具备自身被诱导成DC。 CML克隆起源的DC，利用自身高表达MHC分子，共刺激分子及黏附分子，可将双刺激信号传递给T细胞，诱导特异性CTL，故在免疫效应发挥作用[4]。为了解CML-DC的生物学特性，本研究体外诱导培养CML-DC，并探讨人CML总RNA体外转染对CML-DC抗原递呈功能的影响。

本实验采用经典的培养DC的细胞因子组合GM-CSF＋IL-4＋TNF-α 将 CML-BMMNC 诱生成大量具有毛刺形状DC。我们检测CML-DC经诱导分化前后的表型变化，结果显示刚分离的CML细胞CD1α、CD83阳性细胞小于5%，体外诱导14d后，CD1α、CD83 阳 性 细 胞 分 别 占 21.13±3.45% 、25.76±2.78%。 CD1α、CD83是成熟 DC 的表面标记，证明了CML-BMMNC可诱导成熟的DC。同时，我们应用了染色体G显带技术及巢式RT-PCR技术对CML-DC进行了检测，均具有Ph1染色体及bcr-abl融合基因存在，证明了CML-DC具有白血病源性。

白血病DC疫苗系体外诱导扩增的DC用各种方式负载上白血病抗原然后回输患者体内的一种免疫治疗策略。但每种抗原负载方式产生的CTL作用不同，且各有其优缺点[5-7]。DNA负载DC虽然最能诱导特异性的CTL反应，但RNA负载的DC也能产生较特异性的CTL作用，可以诱导针对不同表位的多克隆CD8＋CTL和CD4＋CTL，具有以下优点：疫苗相对安全，RNA半寿期短，不会整合到基因中，不要求对肿瘤抗原作出鉴定，而且阳离子脂质体作为转染载体的技术也比较成熟[8-10]。综合考虑以上因素，为诱导更特异性的抗白血病CTL免疫反应，本实验以CML细胞的总RNA负载CML-DC。本实验采用10μg总RNA/106DC的比例进行转染，从体外杀伤实验结果来看，达到了RNA成功转染的目的。提示CML总RNA通过脂质体转染CML-DC的可行性和高效性。而以裸总RNA直接转染CML-DC，所诱导的CTL明显低于经脂质体介导转染的CML-DC所诱导的CTL，略高于单纯CML-DC所诱导的CTL。结果说明，用裸RNA转染DC，虽然避免了脂质体对DC的毒性，但因没有载体介导，且RNA自身又易降解，因此转染效率低下。

综上所述，慢性粒细胞白血病的骨髓单个核细胞经细胞因子诱导后可以生成CML-DC，具有DC典型的形态和功能，经脂质体转染CML细胞总RNA可以提高CML-DC的抗原递呈功能，介导更强的抗自身CML细胞的特异性免疫杀伤作用。

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