人诱导多能干细胞自然分化过程中E MT变化研究

林媛媛 ，娄远蕾 ，梁昌达 ，谢淑佩 ，谢安

(1、江西省儿童医院血液科，江西 南昌330006；2、南昌大学泌尿外科研究所，江西 南昌330006)

上皮－间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一种基本的生理病理现象，是指上皮细胞在特定的生理和病理情况下向间质细胞发生转化的现象，是一种哺乳动物胚胎发育与器官形成中的必需的生理过程[1]。由于EMT是上皮细胞获得迁移能力的有效方法，越来越多的研究发现，大量上皮细胞恶性肿瘤的浸润肌转移与此有关，因此研究EMT的发生和调控机制，对于寻找治疗恶性肿瘤特别是肿瘤转移的目标靶点的研究具有重要意义。

诱导多能干细胞 (induced pluripotent stem cells，iPS细胞)是通过向体细胞中导入诱导基因，使体细胞重编程获得具有胚胎干细胞 (ES细胞)样特性的多能干细胞[2]。IPS细胞在细胞形态，生长特性，标志物，畸胎瘤形成等各类生物学特性均与胚胎干细胞类似[3]，同ES细胞一样，iPS细胞可作为胚胎发育的一个模型，同时干细胞与肿瘤相似的增殖及分化特性，对人iPS细胞的EMT的研究，对于研究EMT在组织胚胎发育以及肿瘤发生转移中调控机制，具有十分重要的作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人iPS细胞系UMC-iPS由中国科学院广州生物医药与健康研究院惠赠[4]。

1.2 主要试剂和仪器 DMEM/F12培养基、Knockout血清替代物、DMEM高糖培养基、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、巯基乙醇、碱性成纤维生长因子b-FGF(Gibco公司)；胎牛血清(北京全式金生物技术有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；反转录试剂盒(TAKARA公司)；兔抗OCT-4(Abcam公司)；Tritc标记牛抗兔IgG(Santa Cruz Biotechnology公司)；兔抗 E-cadherin、兔抗N-cadherin、兔抗Slug及兔抗Snail(Cell Signaling Technology公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)；牛血清白蛋白 BSA(Roche公司)；Ⅳ型胶原酶、DAPI、丝裂霉素C、RA和明胶(Sigma公司)；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司。倒置相差荧光显微镜X71(Olympus公司)，PCR 仪(Biometra 公司)，Western blot电泳及转印系统(Bio-Raid公司)。

1.3 方法

1.3.1 培养基的配置 人iPS细胞培养基：DMEM/F12培养基、20% 的Knockout血清替代物(SR)、1%非必需氨基酸、1mmol/L L-谷氨酰胺、0.1mmol/L β-巯基乙醇、8ng/ml b-FGF。拟胚体(embryoid body，EB)培养基：无b-FGF的iPS细胞培养基。小鼠成纤维细胞培养基：DMEM高糖培养基、10%胎牛血清。

1.3.2 人iPS细胞的传代培养 将人的iPS细胞接种于丝裂霉素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，iPS细胞培养基培养。待集落长满饲养层，用1mg/ml的Ⅳ型胶原酶消化15~20min，将集落吹下，加入3~5ml培养液,轻轻吹散成小集落，均匀接种于饲养层细胞上。

1.3.3 人iPS细胞的分化 为方便收集及后续研究，我们将iPS细胞制备成拟胚体(EB)使其自然分化。操作如下：将消化下来的iPS细胞集落移至一培养皿中,差速贴壁30min,去除剩余的饲养层细胞,EB培养基吹打成小的细胞团,接种到低黏附的细菌培养皿中培养，隔天换液，分别于0d、7d、14d、21d、28d收集EB细胞检测。

1.3.4 人iPS细胞的鉴定 免疫荧光染色：4%多聚甲醛固定15min，1%BSA 37℃ 封闭30min,加入OCT-4一抗 (1：100)，37 ℃孵育 2 h，PBS洗涤后加入荧光标记二抗 (1：200)，37℃孵育1 h，PBS洗涤后DAPI(1：100)染核5 min，洗涤晾干后甘油封片，荧光显微镜观察并拍照。AP染色：参考试剂盒说明书操作，细胞染蓝紫色为阳性。

1.3.5 RT-PCR检测 收集未分化(DO)及分化7d、14d、21d、28d(DO~D28)的 iPS 细胞，Trizol法提取总RNA，按照逆转录试剂盒说明书进行操作，用随机引物逆转录合成cDNA后进行PCR扩增，PCR反应条件如下：94℃预变性 5min，94℃变性 30 s，60℃退火 30s，72 ℃ 30 s，30 个循环，72℃延伸10min。GAPDH作为内参。各引物序列及产物长度如下：AFP (171bp)：F5' -AAAAGCCCACTCCAGCAT C-3'，R5'-ATAGCGAGCAGCCCAAAGA-3'；Flk-1(136 bp)：F 5'-AGTGGTATGGTT CTTGCCTCAG-3'，R 5'-AGCCGCTTGTCTGGTTTGA-3'；Pax6(239b p)：F5'-TTT CAGCACCAGTGTCTACCA-3'，R 5'-CATAACTCCGCCCATTCA-3'；E-cadherin(220bp)：F5'-GCTCTTCCAGGAACCTCTGTG-3'，R5'-CAGC TTGAACCACCAGGGTA-3'；N-cadherin(224 bp)：F 5'-GAGCTTG TCAGGATCAGGTCTG-3'，R5'-A ATGTCAATGGGGTTCTCCAC-3'；Slug(223 bp)：F5'-CGCTCCTTCCTGGTCAAGA-3'，R5'-AAGAGGAG AGAGGCCATTGG-3'；Snail(259bp)：F 5'-CCAAT CGGAAGCCTAACTAC-3'，R5'-CCTTTCCCACT GTCCTCATC-3'；GAPDH(312 bp)：F5'-ATCCCAT CACCATCTTCC-3'，R5'-GAGTCCTTCCACGATA CCA-3'。扩增产物经含Goldviewnal型核酸染色液的1.5%(w/v)琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3.6 蛋白印记技术(Western Blot)检测 各组样品取等量蛋白质30μg，经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。经5%脱脂奶粉于室温封闭1h后，加入带检测抗体，室温孵育2h；洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体(1：2000)，室温孵育1h，洗膜，用ECL化学发光试剂盒检测杂交信号。化学发光检测系统取像并分析。

2 结果

2.1 人iPS细胞的生长状态及未分化鉴定 iPS细胞呈典型的克隆状生长。克隆呈圆形或椭圆形，生长旺盛，克隆边界清晰，克隆内细胞排列紧密，高倍镜下形似鸟巢。人iPS的集落与饲养层之间的边界清楚，推开饲养层生长。一般每3~4d传代。AP染色及OCT-4免疫荧光染色阳性，示人iPS细胞处于未分化状态。见图1。

2.2 人iPS细胞自然分化时基因表达变化 为判断人iPS细胞是否自然分化，我们检测了三陪层细胞的标记物AFP、FLK-1及Pax6，D0未见iPS细胞表达，提示细胞处于未分化状态，D7~D28，三者具有表达，提示iPS细胞已发生分化。RT-PCR分析EMT相关基因发现，iPS细胞在未分化时(D0)E-cadherin转录因子表达明显，并且在自然分化状态仍持续表达(D7~D28)，而N-cadherin转录因子在iPS未分化状态未见表达，细胞发生分化后，N-cadherin转录因子的表达迅速上调。Snail和Slug转录因子为E-cadherin蛋白抑制物，我们RT-PCR分析发现，iPS细胞在未分化时(D0)，Slug未见表达，Snail也仅见低水平表达，但细胞发生分化后(D7~D28)，Snail和Slug转录因子的表达均得到增强。见图2。

图1 iPS细胞生长及未分化鉴定

图2 人iPS细胞自然分化时基因表达变化

2.3 人iPS细胞自然分化时EMT相关蛋白表达变化 通过对人iPS细胞总裂解产物的Western blot分析发现，细胞未分化时(D0)，总E-cadherin蛋白表达明显，但细胞分化后(D7~D28)，E-cadherin蛋白表达量迅速下调，仅见微量表达；与此相反，细胞未分化时(D0)总N-cadherin蛋白未见表达，而细胞分化后其蛋白表达逐渐升高。与此同时，细胞未分化时Slug与Snail蛋白均未见表达，而细胞分化后(D7~D28)，Slug与Snail蛋白表达明显上升。见图3。

图3 人iPS细胞自然分化时EMT相关蛋白表达变化

3 讨论

EMT以上皮细胞极性的丧失及其间质特性的获得为主要特征，与胚胎的形成、发育和肿瘤的侵袭转移有关。研究表明，EMT发生过程中最重要的标志性变化是上皮细胞标志物E-cadherin的减少或丢失，间质细胞表型标记物N-cadherin等表达上调[5]。为检测人iPS细胞在自然分化过程中是否发生EMT转变，我们采用RT-PCR和Western blot检测iPS细胞在自然分化前后相关基因和蛋白的改变。Western blot结果表明，未分化iPS细胞可见E-cadherin蛋白的表达，分化后E-cadherin的表达明显减少，而N-cadherin在细胞未分化时未见表达，发生分化后表达明显上调。表明iPS细胞自然分化时发生了由上皮细胞向间质细胞转化的EMT。

Snail是一种含有锌指结构的DNA结合蛋白，可以识别并与E-cadherin启动子部位的E-box结合,抑制E-cadherin基因的表达[6]，迄今为止，所有EMT过程研究中，均发现Snail基因参与其中，细胞中Snail与E-cadherin的表达呈负相关[7]，缺乏E-cadherin的细胞出现大量的Snail，将Snail转染至E-cadherin阳性的细胞将诱导EMT的发生，并表达出间质标记物[8]。Slug和Snail同属于一个转录因子家族，主要作用与神经嵴细胞的发育以及几种中胚层来源的器官如肺、后肾等的形成有关，主要表达在上皮细胞和未分化的间质细胞中，维持未分化表型[9]。与Snail一样，Slug也可以下调E-cadherin的表达。本研究中发现，在人iPS细胞分化过程中，Snail和Slug转录因子以及蛋白都明显发生上调，显示iPS细胞分化后E-cadherin的表达下调可能与Snail和Slug的调节有关。

iPS细胞具有ES细胞的发育多潜能性，并且回避了ES细胞长期以来的伦理争议，因此除细胞替代等临床应用研究外，在胚胎发育、组织功能等基础研究方面也具有独特的优势并越来越受到重视[10]。此外，iPS细胞在癌症研究中也能发挥巨大的作用，从某些方面来看，iPS细胞与肿瘤细胞具有很多相似之处，比如，它们都具有永生化特点，并能致瘤，抗癌基因p53失活能够使重编程速度得到极大提升等[11,12]。目前甚至有研究发现，用iPS细胞培育出癌症干细胞[13]。因此利用iPS细胞作为模型，探索其分化时EMT的转变过程，对于研究组织胚胎发育以及肿瘤细胞发生转移过程中EMT的变化及分子机制，具有十分重要的作用。

[1]Cavallaro U,Christofori G.Cell adhesion and signaling by cadherins and Ig-CAMs in cancer[J].Nat Rev Cancer 2004,4(2):118-32.

[2]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[3]冯年花,谢安,娄远蕾,等.人诱导性多能干细胞的培养及鉴定[J].实验与检验医学,2010,28(1):6-8.

[4]Cai J,Li W,Su H,et al.Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells[J].J Biol Chem,2010,285(15):11227-11234.

[5]Bates RC,Mercurio AM.The epithelial-mesenchymal transition(EMT)and colorectal cancer progression [J].Cancer Biol Ther,2005,4(4):365-370.

[6]Kang Y,Massague J.Epithelial-mesenchymal transitions:twist in development and metastasis[J].Cell,2004,118(3):277-279.

[7]Barrallo-Gimeno A,Nieto MA.The Snail genes as inducers of cell movement and survival:implicationsin development and cancer[J].Development,2005,132(14):3151-3161.

[8]Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transition in tumor progression[J].Nature Rev Cancer,2002,2(6):442-454.

[9]Rhim H,Savagner P,Thibaudeau G,et al.Localization of a neural crest transcription factor,Slug,to mouse chromosome 16 and human chromosome 8[J].Mamm Genome,1997,8(11):872-873.

[10]Lewitzky M,Yamanaka S.Reprogramming somatic cells towards pluripotency by defined factors[J].Curr Opin Biotechnol,2007,18(5):467-73.

[11]Hong H,Takahashi K,Ichisaka T,et al.Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway [J].Nature,2009,460(7259):1132-1135.

[12]Utikal J,Polo JM,Stadtfeld M,et al.Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPS cells[J].Nature,2009,460(7259):1145-1148.

[13]Chen L,Kasai T,Li Y,et al.A Model of cancer stem cells derived from mouse induced pluripotent stem cells[J].PLoS One,2012;7(4):e33544.