小脑顶核电刺激干预在卒中后抑郁大鼠细胞因子发病机制中的作用

李宝强，隋汝波，张 磊，刘欣跃辽宁医学院附属第一医院 神经内科，辽宁锦州 00；辽宁医学院，辽宁锦州 00

卒中后抑郁(post-stroke depression，PSD)是卒中的常见并发症之一，占卒中患者的20%~50%[1]。PSD严重阻碍了卒中患者神经功能和日常生活能力的恢复，并与卒中患者的社交回避和病死率增高密切相关[2]。Spalletta等[3]认为抑郁患者血中炎性细胞因子水平明显增加，导致了抑郁。近年大量临床研究发现电刺激小脑顶核能显著改善抑郁症状[4]。本文通过电刺激小脑顶核后观察PSD大鼠海马组织中炎性细胞因子水平的变化，进而探讨电刺激小脑顶核对PSD大鼠海马细胞因子变化的影响。为新型抗抑郁方法的研发提供依据。

材料和方法

1 实验动物 选用健康雄性SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠72只，体质量250~350 g(辽宁医学院实验动物中心提供)。许可证号：SCXK(辽)。实验动物级别：普通级。

2 试剂和仪器 RNAiso Plus，TNF-α，IL-6，IL-1β反转录试剂盒、RNA提取试剂盒购日本TAKARA公司；无RNA酶水购自美国Thermo公司；IL-1，IL-6，IL-1βRat Elisa Kit购自美国R&D公司。BH6018型四探头自动r计数器：北京核仪器厂；ABI PRISM 7900HT荧光定量PCR仪：Sigma；RF-5000荧光分光光度仪：Sigma；脑立体定位仪：中国深圳瑞沃德生命科技有限公司；离心机1-14K：Sigma；酶标仪Sigma 960：Sigma；匀浆机：Sigma。

3 动物分组 将实验大鼠适应饲养1周，自然昼夜节律光照，自由摄食进水，通风良好，(21±2) ℃恒温。期间训练饮用蔗糖水消耗和旷野实验(openfield test，OFT)基线值。选择评分相近大鼠72只，随机分为四组，每组18只。假手术组：给予假手术处理，除拴线不插入颈总动脉外，余同手术组；卒中组：行大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)术；卒中后抑郁(PSD)组：MCAO术后第3天加以慢性不可预见的温和刺激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，小脑顶核电刺激组：CUMS结合孤养法后在各个时间点行小脑顶核电刺激(60 Hz，60 min)，共计3次，直到CUMS流程结束。

4 大鼠局灶性脑缺血模型的建立[5](middle cerebral artery occlusion，MCAO) 手术前12 h禁食不禁水。选用标准大鼠麻醉剂量，以10%水合氯醛3 ml/kg，经腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上，颈部正中切开皮肤及浅筋膜，钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌，暴露左侧颈总动脉(CCA)和迷走神经、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA)、ICA的颅外分支翼腭动脉，在近心端结扎CCA，在颈总动脉分叉处结扎ECA，结扎翼腭动脉。将ICA远心端用动脉夹夹闭，距颈总动脉分叉处近心端0.5 cm处将颈总动脉剪一小口，插入备好的碳素鱼线，去除动脉夹，沿着ICA轻轻向前推进，注意不要误入翼鄂动脉，当到达指定长度(18 mm左右)时结扎ICA并固定鱼线。假手术组动物，除手术过程中不插入线栓以外，其他过程相同。以青霉素局部消毒后缝合皮肤。术后保持环境温度在25~30 ℃左右。尤其要注意动物头部的保温。模型成功的标志是大鼠即刻出现右侧Horner征。

5 建立大鼠卒中后抑郁模型 CUMS：按Willner等[6]和Katz等[7]的方法：1)禁食禁水20 h，2)禁水17 h，3)倾斜鼠笼，共18 d。孤养：将PSD和FNS组动物单笼饲养。

6 行为学观察和测试 CUMS开始第7、14、21天，行旷野实验测试，每周行蔗糖水实验并测量体重，应激结束后行强迫游泳实验。1)旷野实验：室内隔音，测定5 min水平和垂直运动得分及中央格停留时间、修饰次数和粪便颗粒；2)蔗糖水实验：20 h禁食禁水后，测定1 h糖水饮用比例(糖水消耗/总液体消耗×100%)；3)强迫游泳实验：连续观察5 min，累计大鼠在水中停止挣扎、成漂浮状态的时间。

7 RNA提取和Real time-PCR 动物完成观察时间后，于相应时间点，在大鼠尽量安静的条件下迅速断头取脑，在冰盘上迅速分离出病灶侧(正常组相对应侧)的海马区脑组织，立即放入液氮中保存，按下面不同方法进行各项指标检测。取液氮中保存的各时间点海马标本，按照RNAiso Plus一步法提取组织总RNA。紫外分光光度计测定浓度和纯度。取总RNA 2 μg用逆转录试剂盒合成cDNA，再行PCR扩增。RT-PCR引物由上海生工生物工程公司合成，序列如下：TNF-α：5'-TCT TCT CAT TCC TgC TCg Tgg-3'(上游)，(下游)，5'-CCT CCT TgT Tgg Gac CgA T-3'，长度为110 bp；IL-1β：5'-CCT CgT gCT gTC TgA CCC AT-3'(上游)，5'-gCC ACA ggg ATT TTg TCg TT-3'(下游)，长度为131 bp；IL-6：5'-ACA AAg CCA gAg TCA TTC AgA gC-3'(上 游)，5'-ggA AgT Tgg ggT Agg AAg gAC T-3'(下游)，长度为135 bp；β-Actin：5'-TACATGGTCTACATGTTCCAGTATG-3'(上 游)，(下 游)5'-CAGGAGGCATTGCTGACAATCTTG-3'，长度127 bp。扩增条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃15 s，60 ℃ 15 s。反应在ABI PRISM 7900HTPCR仪上进行。为了控制样本间mRNA质量的变异，同时检测βactin基因表达表达。结果采用SDS软件进行相对定量分析。

8 ELISA法检测海马组织IL-6，IL-1β及TNF-α蛋白表达 严格按照Rat Elisa Kit说明书操作。

9 统计学处理 实验数据计量资料均用-x±s表示(先经正态性检验)，采用SPSS17.0统计软件：多组计量资料显著性检验进行单因素方差分析(oneway ANOVA)和两两比较(LSD法)。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠行为 与对照组相比，卒中组在应激状态下，大鼠的体质量及糖水消耗略有下降，垂直运动略有下降(cP＜0.01)；与卒中组相比，PSD组大鼠体质量和糖水消耗量下降，垂直运动降低(aP＜0.01)；FNS组可增加PSD大鼠体质量和糖水消耗量，提高垂直运动水平(bP＜0.01)。见表1。

2 Real time-PCR法检测海马组织中IL-6、IL-1β及TNF-α mRNA表 达 IL-6、IL-1β 及TNF-α 的mRNA在正常大鼠海马组织中呈低水平表达，与对照组比较，在卒中组海马组织中三种细胞因子mRNA含量于MCAO术后应激作用下开始增加(P＜0.05)，14 d达到高峰(P＜0.05)，随后开始迅速下降；与卒中组比较PSD组三种细胞因子mRNA水平均不同程度显著增加(P＜0.05)IL-6 mRNA表达以后虽有所降低，但三种细胞因子mRNA表达仍均维持于较高水平(P＜0.05)；与PSD组比较，FNS组三种细胞因子mRNA水平均不同程度降低(P＜0.05)。见图1。

3 ELISA法检测海马组织IL-6，IL-1β及TNF-α蛋白水平的表达变化 与卒中组比较，PSD组大鼠海马组织中IL-6，IL-1β及TNF-α的蛋白表达明显升高(P＜0.05)；与PSD组比较，FNS组三种细胞因子蛋白表达不同程度降低(P＜0.05)。见图2。

表1 各组大鼠在不同时间点的体质量变化Tab. 1 Weight of rats in different groups at different time points (g)

表2 各组大鼠在不同时间点的糖水消耗Tab. 2 Sugar consumption of rats in different groups at different time points (ml)

表3 各组大鼠不同时间点的垂直运动水平Tab.3 Vertical motion of rats in different groups at different time points (cm)

讨 论

本研究结果表明，电刺激小脑顶核后PSD大鼠体质量增加，蔗糖水消耗增加，同时PSD大鼠在旷野试验中水平运动评分也增加，因此，FNS后PSD大鼠的抑郁症状改善。Schutter等[8]在应用经颅重复电刺激小脑治疗抑郁的研究中证实，电刺激小脑能显著改善抑郁症状。然而，关于电刺激小脑顶核治疗PSD的基础研究尚未见报道。

本实验也着眼于对PSD大鼠FNS前后海马组织炎性细胞因子基因及蛋白表达变化的研究。与卒中组相比，PSD时炎性细胞因子IL-6，IL-1β及TNF-α水平明显升高；与PSD组相比，FNS后炎性细胞因子IL-6，IL-1β及TNF-α表达显著降低。目前，PSD的发病机制不明，细胞因子学说是公认的最重要假说，它阐述了PSD后IL-6，IL-1β及TNF-α等炎性细胞因子水平持续升高[9-10]。本研究中PSD后炎性细胞因子升高与此学说一致。同时，电刺激小脑顶核可能通过稳定细胞因子网络改善PSD大鼠的抑郁症状。国内刘竞丽等[11]应用电刺激小脑顶核治疗PSD患者41例，结果显著改善了PSD患者的抑郁症状，与本研究结果相符，但FNS后细胞因子降低的机制尚无研究。电刺激小脑顶核能极显著地抑制炎症反应，降低细胞因子水平，这种作用主要是通过对下丘脑外侧区和室旁核的抑制来完成的[12-13]。这可能是FNS后PSD大鼠抑郁症状改善的原因。

图 1 IL-6、 IL-1β and TNF-α mRNA在PSD大鼠海马组织中的表达 与对照组比较， 卒中组3种细胞因子mRNA表达增加(aP＜0.05)； 与卒中组比较， PSD组3种细胞因子mRNA表达明显增加(bP＜0.01)； 与PSD组比较， FNS组3种细胞因子mRNA表达下降(cP＜0.05)Fig. 1 Expressions of IL-6, IL-1βand TNF-αmRNA in hippocampal tissues of PSD rats aP＜0.05, vs control group, bP＜0.01, vs stroke group, cP＜0.05, vs PSD group

图 2 IL-6、IL-1β and TNF-α在PSD大鼠海马组织中的蛋白含量测定 与对照组比较，卒中组3种细胞因子蛋白含量有所增加(aP＜0.05)；与卒中组比较，PSD组3种细胞因子蛋白含量明显增加(bP＜0.01)；与PSD组比较，FNS组3种细胞因子表达下降(cP＜0.05)Fig. 2 Protein levels of IL-6, IL-1βand TNF-α in hippocampal tissues of PSD ratsaP＜0.05, vs control group, bP＜0.01, vs stroke group, cP＜0.05, vs PSD group

目前临床抗抑郁药疗效已经得到广泛认可，但其价格昂贵以及不良反应给患者造成经济负担及身体伤害。本研究结果表明电刺激小脑顶核能显著降低PSD大鼠海马组织细胞因子水平，进而改善PSD大鼠的抑郁症状。FNS后降低海马组织细胞因子水平的机制仍不明确，可能与其双向免疫调节功能有关[14-15]。即维持体内免疫系统处于平衡状态：既能提高免疫功能，又能防止免疫系统的矫枉过正，既阻止致炎性细胞因子的过度生成同时又防止抗炎性细胞因子的过度减少，从而稳定细胞因子网络平衡，达到治疗PSD的目的。国内外关于电刺激的神经保护作用研究较多，但尚未发现有关于电刺激对PSD作用研究的报道，而其对PSD时海马组织炎性细胞因子影响的研究更尚未见报道。本实验从此角度研究电刺激的保护作用，从而为PSD的治疗提供新的思路及实验依据。

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