脐带华通胶间充质干细胞治疗缺血性心脏病临床疗效观察

张晓霞，王晓曦，段海峰，陈光辉解放军总医院 心内科，北京 0085；总政治部机关医院 心内科，北京 000；军事医学科学院放射医学研究所，北京 00850

冠状动脉粥样硬化疾病是缺血性心脏病的首要原因，随着介入治疗及外科手术等冠脉血运重建技术的发展，缺血性心脏病患者的生存率有了很大提高，然而幸存者有相当一部分发展为充血性心力衰竭，心脏功能受到很大限制，生活质量低下[1]。由于心肌细胞再生能力极低，心肌缺血引起的心肌不可逆性损失成为缺血性心脏病治疗中面临的最大挑战。近年来，干细胞研究成为心脏再生医学的重要方向，动物实验和临床前期研究都显示出了令人鼓舞的结果，多种干细胞都被证实具有减少心肌凋亡、改善心肌供血、提高心脏功能的作用[2-3]。其中，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)由于其高分化潜能、低免疫源性、易于制备等特性被广泛应用[4]。人脐带华通胶间充质干细胞(Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs)来源于脐带中的特殊胚胎黏膜结缔组织，采集方便，对供体没有伤害，不涉及伦理问题，在体外比骨髓MSCs有更强的扩增能力和更快的生长速度，因此是干细胞治疗的理想来源[5]。本实验对缺血性心脏病心功能不全患者进行了WJ-MSCs经冠脉移植治疗并进行随访，观察其临床治疗的安全性和有效性。

资料和方法

1 患者资料 选择解放军总医院2010年12月-2012年1月住院的缺血性心脏病心功能不全患者30例，其中男性25例，女性5例；年龄40~80岁，平均(60.5±3.7)岁；病程1~5年，平均病程2年。均经冠状动脉造影均确诊为冠心病(含单支、双支、多支病变)，超声心动图显示左室射血分数＜50%；心功能(NYHA)分级Ⅱ~Ⅳ级，有胸闷、气急、日常活动轻到中度受限、下肢水肿或夜间阵发性呼吸困难等症状。其中陈旧性心肌梗死13例，既往植入1~3枚支架21例，既往行冠状动脉搭桥术2例，合并高血压病14例，合并糖尿病8例。除外结构性心脏病、瓣膜性心脏病、顽固性高血压(血压控制不稳定)、严重肝肾功能不全、活动性消化道出血、恶性肿瘤、深静脉血栓及合并感染者。将患者随机分为治疗组与对照组各15例，两组患者年龄、性别、基础心脏病、心功能分级、肝肾功能及血脂等方面差异均无统计学意义(P＞0.05)，患者本人及检查、治疗医师对患者分组情况不知晓。所有患者都按目前冠心病治疗指南接受系统药物治疗，并遵循标准的康复计划。本实验经伦理委员会批准，治疗均经患者同意并已签订知情同意书。

2 细胞制备 经父母同意后取得出生后新鲜婴儿脐带，具体制备步骤见文献[6]。去除脐动静脉后残余组织剪碎成0.5~1.5 mm的组织块，加入Ⅱ型胶原酶(2 mg/ml)置37℃恒温振荡培养箱振荡消化3~4 h，70 μm滤网过滤。将细胞悬液在4 ℃、2 000 r/min离心30 min后洗涤，重悬于完全培养液中。以1×104/cm2密度将细胞接种于培养基中，置37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。72 h后去除非贴壁细胞，每隔3~4 d换液。细胞融合至80%加入胰酶消化传代。流式细胞仪检测CD14、CD31、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105和HLA-DR的表达，行WJ-MSCs体外诱导分化实验鉴别细胞特性。所有实验应用第3~5代细胞进行。

3 细胞移植 所有患者均在治疗开始前接受阿司匹林和抗凝肝素(0.7 U/kg)。常规穿刺右桡动脉行冠状动脉造影(穿刺不成功者改用股动脉)，对有意义病变进行血运重建；选择既往梗死相关动脉或心脏供血优势动脉，将微导管置入该动脉中远段，分5次缓慢注入10 ml干细胞悬液(细胞数2×107)或0.9%氯化钠注射液，即刻复查冠状动脉造影观察有无冠脉血流变化。治疗过程中严密观察患者临床症状、生命体征及心电图变化。

4 疗效评价 患者治疗前检查血尿常规、血糖、血脂、肝肾功能、心肌酶、电解质、肿瘤标记物、心电图、超声心动图，采用SF-36健康调查量表评价生活质量，包括身体功能、运动限制和总体健康评分[7]。由2位有经验的心脏超声医师共同评定超声心功能(Siemens Acuson彩色多普勒超声诊断仪)。干细胞移植后3 d复查心电图与实验室指标，术后3月、6月复查实验室指标、心电图、超声心动图、SF-36健康量表。治疗及随访中记录患者有无死亡、心肌梗死、严重心律失常、再血管化、心衰加重再住院、心绞痛再住院、脑梗死、新生肿瘤等严重不良临床事件。

5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。计量资料以-x±s表示，计数资料采用χ2检验比较两组临床事件发生率；采用重复测量的方差分析进行治疗前后及组间临床资料比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 细胞特性 流式细胞仪分析表明，所得细胞表达间充质干细胞特异性抗原CD73、CD90、CD105，而不表达造血和内皮细胞表面标志(CD14、CD31、CD34和CD45)，移植免疫排斥反应相关表面标志物(HLA-DR)阴性。WJ-MSCs在体外能够分化为肌细胞、骨细胞和软骨细胞。

2 疗效 所有患者冠状动脉细胞输注成功，没有引起冠脉血流量变化，治疗时和术后在院期间耐受性良好，无心绞痛发作，无心衰新发或加重，无发热和过敏反应。术后随访6个月内，治疗组1例出院1月后因劳累诱发心衰加重再住院，对照组1例术后2月因心绞痛发作再住院，均药物治疗后缓解，余患者无严重不良临床事件发生，两组差异无统计学意义(表1)。二组治疗前后血尿常规、肝肾功、心肌酶、肿瘤标记物水平无统计学差异(P＞0.05)。

3 两组超声心动图比较 治疗组术后3月及6月左室舒张末容量(LVEDV)和左室收缩末容量(LVE SV)均较术前显著减小(P＜0.05)，左室射血分数(LV EF)术后3月及6月较术前提高，差异有统计学意义(P＜0.05)。对照组LVEDV、LVESV及LVEF变化无统计学意义。组间差异比较虽无统计学意义，但治疗组较对照组LVEF有明显上升趋势(表2)。

4 两组SF-36健康量表评分比较 治疗组与对照组术后3月、6月较治疗前身体功能及总体健康评分均有显著提高(P＜0.05)，治疗组术后6月较术后3月评分改善仍有统计学意义(P＜0.05)。运动限制评分变化二组均不显著。组间差异比较显示总体健康评分二组差异有统计学意义(P＜0.05)，余评分差异无统计学意义(表3)。

表1 WJ-MSCs冠脉移植后6月两组主要负性临床事件比较Tab. 1 Main adverse clinical events 6 months after coronary WJ-MSC transplantation(n)

讨 论

本研究表明冠心病心功能不全患者冠脉内WJ-MSCs移植在目前是安全而有效的。在治疗期间及之后6个月随访中没有发现异体细胞移植引起的免疫排斥反应，未发现异位组织形成，两组患者发生严重不良临床事件差异无统计学意义。其长期安全性我们将在今后的随访中加以观察。

既往研究发现增殖、分化能力强的胚胎干细胞和诱导多能干细胞可能具有的致瘤性是限制其临床应用的重要因素[8]。动物实验证明，通过对元代、早代和晚代WJ-MSCs核型的观察，以及将超过实验常用量很多的细胞移植到小鼠体内后，在观察期内均未发现肿瘤组织形成[9]。本实验在移植后6个月的随访中未发现异位组织形成，相关肿瘤标志物水平无明显改变也与该结果相符合。

目前已有许多实验证实同种干细胞移植可改善心脏功能、减少心梗面积，本实验结果也验证了这一点，显示WJ-MSCs冠脉内移植对于患者心功能和生活质量有明显改善。WJ-MSCs改善心肌功能的机制还不是很清楚，可能与以下机制相关。1)华通胶间充质干细胞(WJ-MSCs)来源于脐带的黏膜结缔组织，除了具有间充质干细胞的共同特性外，由于其在发育迁移过程中环绕在胚胎血岛细胞周围，还少量地表达与胚胎干细胞相近的干性基因标志和早期心肌转录因子，因此比起其他来源的成体干细胞具有更强的分化潜能[10]。2)旁分泌功能是干细胞移植发挥作用的重要途径[11]。干细胞移植后释放多种细胞因子，既可以影响干细胞小生境，改善其自身生存环境，又可以影响相邻的实质和间质细胞在正常和病理条件下的生物学特性，提高细胞存活、促进血管新生，激活内源性的修复和再生机制[12]。随访中我们发现，治疗组4例合并糖尿病患者血糖均控制良好并伴不同程度药物减量，1例术后半月脱离口服降糖药(二甲双胍、阿卡波糖)，糖化血红蛋白术前8.8%，术后3月及6月分别为6.7%、6.8%。1例合并帕金森症的患者治疗后肢体静止性震颤明显减轻。我们分析可能与冠脉内移植的WJ-MSCs随血液循环归巢于外周患处以及旁分泌生成的一系列细胞因子改善局部再生能力低下细胞(胰岛B细胞、神经细胞)的功能有关[13-14]。对此将在后续试验中加以研究。

表2 WJ-MSCs冠脉移植前后两组心功能比较Tab. 2 Cardiac function of two groups before and after coronary WJ-MSC transplantation(-x±s)

表3 WJ-MSCs冠脉移植前后两组SF-36生活质量评分比较Tab. 3 Scores of SF-36 and quality of life in two groups before and after coronary WJ-MSC transplantation(-x±s)

本实验存在病例数不够多、随访时间不够长的不足，将在下一阶段的实验中加以改进。虽然目前多数干细胞移植临床试验随访时间较短，对于其改善心功能的长期疗效仍然存疑，但已有少量长期随访的结果显示心功能不全患者冠脉内移植干细胞后5年主要不良心血管事件(MACE)发生率较对照组显著减少[15]。对于各种方案治疗效果不佳的缺血性心脏病患者，干细胞冠脉内移植将提供一种安全有效的治疗选择。

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