鱼糜固态发酵工艺与其生化指标动态变化的研究

赵培城，韩 晓，丁玉庭，倪佳蕾，王丽娟，毛红骞

（1.浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310032；2.杭州市质量计量监督检测院，浙江 杭州 310019）

鱼糜固态发酵工艺与其生化指标动态变化的研究

赵培城1，韩 晓1，丁玉庭1，倪佳蕾1，王丽娟1，毛红骞2

（1.浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310032；2.杭州市质量计量监督检测院，浙江 杭州 310019）

为了提高海产低值鱼糜食用价值，通过单因素和正交实验，研究利用绍兴腐乳毛霉进行海产低值鱼糜固态发酵的条件，及其发酵过程中生化指标的动态变化规律.结果表明，毛霉固态发酵鱼糜的最佳工艺：鱼糜初始水的质量分数65%，氯化钠质量分数1%，葡萄糖质量分数2%，玉米淀粉质量分数5%，大豆分离蛋白质量分数10%，蒸汽加热后接种，固态培养48 h后酶活达60 U／g以上，感官评价值为43.5.通过测定固态发酵过程中水的质量分数、pH、总酸、ANN、TVB-N、蛋白酶活力和质构变化，揭示固态发酵过程中的机理.

腐乳；鱼糜；毛霉；固态发酵

近年来由于海洋渔业的发展，海洋渔业的原料结构发生一些改变，海洋捕捞产品中低值鱼所占比例加大，开发低值鱼的水产品加工技术也就成为研究热点［1－3］.

经测定本实验所用鱼糜在蛋白质含量，质地等方面都与豆腐有一定的相似之处.受我国传统食品—腐乳（Fermented bean curd）独特加工工艺启发，在借鉴绍兴腐乳千年生产工艺技术的基础上，对海产低值鱼糜进行生物改性技术的工艺研究，并探索其生化指标动态变化规律，将鱼糜的深加工与腐乳加工工艺相结合，发酵生产出新的食品—鱼腐乳，为今后海产低值鱼鱼糜的加工提供思路和依据.

1 实验内容与方法

1.1 实验材料

毛霉菌株XH-22，绍兴咸亨腐乳厂保藏菌种.

鱼糜，上虞市傣之味食品有限公司生产，海产低值鱼鱼糜，实验室储藏于－80℃冰箱备用.

1.2 实验仪器与设备

CR21GⅡ高速冷冻离心机，日本日立公司；752N紫外可见分光光度计；PHS-3C pH计，上海精科实业有限公司；打浆杯，飞利浦 HR2860；摇床，SUKUN SKY111B；DHG-9070A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海恒科技有限公司；98-Ⅱ型强磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；SW-CJ-2FD双人单面超净工作台；BSP-250生化培养箱，YXQ-LS-50立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂.

1.3 分析方法

pH 值测定：酸度计［4］；水分按 GB／T14769—1993常压加热干燥法测定，温度（105±1）℃，干燥24 h；总酸含量的测定：电位滴定法（GB／T12456-90—1991）；总糖含量测定：硫酸苯酚比色法；灰分测定：高温灼烧法（GB／T5009.4—2003）；脂肪含量的测定：索式抽提法（GB／T14772—2008）；氨基态氮：甲醛滴定法（GB／T5009.39-85—1996）；挥发性盐基氮（TVB-N）：半微量扩散法［4］；蛋白酶酶活力的测定：福林酚法［5］；含盐率测定：按 SC／T3011—2001硝酸银滴定法测定；菌落总数，采用营养琼脂培养基倾注平板法测定.

质构分析：发酵鱼糜质构的测定采用压力测试模式中的TPA测试，选用P6圆柱形探头对样品进行测定.测定条件设置如下：测前速度为1.0 mm／s，测试速度为1.0 mm／s，测后速度为5.0 mm／s，压缩比为30%（非破坏性测试），时间间隔为1.0 s［4］.

感官评价程序和方法：把要鉴定的前酵样品轻轻用镊子从容器中取出，放在培养皿上，培养皿下放一张白纸.首先观察样品颜色、菌膜完整性，闻气味.随后用小刀从中间把样品切开，观察菌膜厚度和致密程度，然后用药勺挑取，在培养皿内涂抹，观察其硬度以及菌膜结合牢固程度，然后填写评分.

1.4 “鱼腐乳”的制备

首先，鱼糜按照比例添加添加剂，边加边擂溃15 min［6］，然后恒温箱内静置30 min，之后蒸汽加热15 min，以灭菌并形成凝胶［7］，于灭菌后的无菌操作台内放凉，无菌操作切成1.5 cm×1.5 cm小块，备用.

固态发酵海产低值鱼糜的加工工艺的确定，一方面参考了浙江绍兴咸亨腐乳厂毛坯发酵工艺，另一方面结合鱼糜自身特点，具体如下：先将取自绍兴咸亨腐乳厂的菌种－毛霉XH-22平板培养3～5 d，用无菌生理盐水将孢子洗脱，洗脱液经高速分散机均质后，用血球计数板在显微镜下计数，最后将菌液按比例稀释到105～106cfu／mL，制成接种液.

放凉后的鱼糜发酵坯六面均匀刷上接种液后，间隔约1cm摆放于底部有孔的无菌塑料杯内，于25℃且空气湿度≥90%的条件下培养，待菌丝长至1～1.5 cm，毛坯发酵完成.

由于固态发酵为开放式培养，菌含量较高，参照咸亨腐乳生产经验，待毛霉菌膜形成时，小心搓倒毛霉菌丝（搓毛）使其均匀包裹在鱼糜块表面，整齐摆放入容器内，加入18%的盐水，腌制约12～16 h，至腌坯含盐量达12%～14%，制成咸坯.咸坯捞出，均匀放于灭菌的广口玻璃瓶内，按照咸坯与卤汁质量比约为3∶2的比例加入卤汁，经3个月左右的后酵即成“鱼腐乳”［8］.

2 结果与讨论

2.1 海产低值鱼糜的宏量成分组成

经测定，海产低值鱼糜的宏量营养成分如表1所示.

其成分分析结果见表1.

表1 原料鱼糜理化成分及微生物分析Table 1 Chemical and microbiological analysis in saltwater fishes surimi

原料质量的好坏对加工制品品质有着重要的影响.鱼肉中水的质量分数一般在66%～84%，蛋白质质量分数为15%～24%，脂肪质量分数为0.1%～22%，碳水化合物质量分数为1%～3%.从表1可以看出：原料鱼糜中水的质量分数较高，占总重的（72.48±2.05）%，其次是蛋白质（14.1%），脂肪的比重较低，挥发性盐基氮的比重很低，在国家标准鱼类的一级鲜度之内（＜15 mg／hg）.原料鱼中最初的微生物特别是致病菌对终产品的质量和安全也起着很重要的作用.从表中可看出乳酸菌和肠道菌均低于103cfu／g，这说明原料鱼微生物指标很好.故原料鱼糜是较好的蛋白质资源，可以作为蛋白质源进一步加工利用，提高其经济价值，避免资源浪费.

2.2 正交实验优化固态发酵工艺条件

腐乳最终选择毛霉作为前期发酵的菌种，主要是因为毛霉具有一定的分泌蛋白酶的能力，菌丝洁白透亮，质地致密，能在坯体表层均匀覆盖一层0.2 cm后的嫩滑菌膜，对产品成型起关键作用［9］.有研究表明，毛霉本身分泌的蛋白酶活力较强，其中性蛋白酶活力最高值65.52 U／g［10］（以干基计）.所以毛霉在腐乳生产中最为重要的作用：赋予腐乳以韧性的菌膜和诱人的色泽［11］以及丰富的氨基酸.所以正交实验的感官评价标准是结合豆腐乳前酵产品感官评价标准［8］和鱼糜自身特点，同时加大风味和质地的比例，具体标准见表2.

表2 毛霉固态发酵前后感官评价标准Table 2 The sensory quality evaluation of the fishes surimi before and after fermentation

实验所用海产低值鱼鱼糜成分见表1，可以看出对于固态发酵培养，鱼糜本身缺少微生物生长必须的碳源类物质，毛霉生长需要淀粉类物质［12］，故选择葡萄糖、玉米淀粉和大豆分离蛋白（SPI）作为添加剂［13］，其添加量的选择参照SC／T3701—2003中规定范围选取；同时多项研究表明盐分的添加对于鱼糜凝胶性能的改善是十分必要的，所以选择以上四种物质做四因素三水平正交实验－L9（34），以中性蛋白酶活力和感官评价为指标，选择出最佳添加剂配比.实验设计表见表3.

表3 正交实验因素与水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal experiment%

对正交实验接种毛霉固态发酵处理后的样品进行感官评价，本样品感官评价表参考沈子林的腐乳感官品评方法［14］，根据情况进行了改善.增加对固态发酵阶段菌膜形成情况的评价（表4）.

表4 L9（34）正交实验结果1）Table 4 The results of the orthogonal experiment

由表4可以看出：三个指标各因素水平的最佳组合：对于蛋白酶活力来说A2B1C3D2；对于感官品质评价来说为A2B1C1D1.四个因素对于蛋白酶活力影响力大小为A＞C＞D＞B；对于感官评价影响力A与C相差不大，A／C＞D＞B.再通过综合平衡分析来确定最优方案：因素A对蛋白酶活力和感官评价来说，均以A2为佳，故选择A2；因素B对蛋白酶活力和感官评价来说，也是以B1为佳，故选择B1为最佳水平；因素C对于蛋白酶活力来说最佳水平为C3，对于感官评价来说最佳水平为C1，再结合两者R值，因素C对于蛋白酶活力影响次于因素A（Rc6.79＜Ra9.94），同时因素C对于感官的影响力Rc7.49与Ra7.82相差不大，这可以解释为微生物酶活与风味的改变有相悖关系，这也与一些鱼糜发酵的工艺研究结果相似，故取C3；因素D对于蛋白酶活力来说以D2为佳，对感官品质评价来说以D1为佳，综合两者影响力来看，蛋白酶活因素D对于蛋白酶活力影响力较大，同时从降低成本角度考虑，选择D2.综合考虑最优方案为A2B1C3D2，即食盐的质量分数为1%，葡萄糖的质量分数为2%，玉米淀粉的质量分数为5%，大豆分离蛋白的质量分数为10%.

2.3 固态发酵过程中鱼糜各项生化指标的变化

2.3.1 固态发酵过程中水的质量分数变化

由图1可知：发酵组和对比组水分含量均随时间增加，而呈下降趋势.24 h后发酵组失水稍大于空白组，是由于0～24 h物料曝露在空气中，挥发失水，而后期随着毛霉的生长，在固态开放式发酵中产生的发酵热加剧水分的散失，从而导致水的质量分数的下降幅度略大于对比组［15］.

图1 毛霉发酵鱼糜水分质量分数的变化Fig.1 The changes in moisture content of fermentation fishes surimi by Mucor

2.3.2 固态发酵过程中pH和总酸的质量分数变化

由图2可以看出：随发酵时间延长，接种毛霉的鱼糜在0～24 h时间段内pH由6.87将至6.28，随后下降速度明显放缓.而对照组的pH值在0～24 h下降之后回升，这是因为在相对开放的环境中，毛霉可以迅速生长并成为优势菌，从而在一定程度上抑制其他菌群的生长，而对照组适于腐败菌滋生，出现类似鱼肉腐败的pH变化规律.总可滴定酸的变化规律与pH相呼应，毛霉的生长对抑制腐败菌的生长有重要意义.

综合pH和总酸的结果显示，单依靠毛霉产酸抑菌，达到改良保藏性的目的是不可行的，还需要借助其他加工方式.

图2 毛霉发酵鱼糜pH和总酸质量分数的变化Fig.2 The changes in pH and TC of fermentation fishes surimi by Mucor

2.3.3 固态发酵过程中TVB-N的质量分数变化

挥发性盐基氮是一些细菌，如假单胞菌等，分泌的蛋白质分解酶分解蛋白质产生的氨及胺类等碱性含氮化合物，从而导致肉类腐败.由图3看出：不论接种毛霉与否，TVB-N值都会随著发酵时间而逐渐增加，但接种毛霉组的TVB-N值上升较慢，在发酵48 h后仍于新鲜标准内（15～25 mg／hg），也没有腐败臭味的产生.而未接种的控制组在发酵到36 h之前即已呈现初期腐败，而60 h已腐败，且散发腐败臭味.这可能是因为有些细菌会利用游离氨基酸等含氮化合物产生挥发性含氮成分，但添加了毛霉发酵剂后毛霉成为优势菌群，抑制这类细菌的生长而降低了氨的生成.另一方面毛霉发酵的鱼肉其TVB-N值未大幅提升，亦可能是有酸性物质生成，造成酸碱中和，使得其TVB-N值未大幅提升.

2.3.4 固态发酵过程中氨基酸态氮的质量分数变化

由图4看出：接种毛霉组ANN的质量分数大幅上升，60 h内从0.03%增加到0.27%.ANN的质量分数增加一定程度上与毛霉的生长，毛霉蛋白酶的分泌有关.有研究表明，毛霉分泌的蛋白酶种类中酸性蛋白酶活力高于中性或碱性蛋白酶，这与pH变化规律也相吻合［16］.空白对照组的ANN也有增长，但12～24 h内其TVB-N的质量分数已表明对照组已进入腐败状态，ANN的上升应该是腐败菌作用的结果.

2.3.5 毛霉发酵鱼糜过程中中性蛋白酶活力的变化

由图5看出：毛霉产酶和菌体生长基本同步，毛霉蛋白酶分解物料大分子蛋白质，生成多肽类物质，提高产品营养价值，并且毛霉蛋白酶主要为内切酶，产生的主要为多肽，可明显增加多肽质量分数［17］.

图5 毛霉发酵鱼糜中性蛋白酶活力的变化Fig.5 The changes in protease activity of fermentation fishes surimi by Mucor

2.3.6 毛霉发酵鱼糜过程中质构的变化

对于TPA，硬度和胶着性能较好反映物料感官适口性［18］，毛霉发酵过程中硬度是先增大后减小，增大是由于前期表层失水，后期下降是由于毛霉的生长，分泌蛋白酶等酶类，酶解鱼糜蛋白，破坏了其凝胶结构，这也和腐乳固态发酵过程中的变化相类似，这也是其弹性下降的原因之一.粘性、胶着性和胶粘度能部分反映物料的韧性和光滑性，二者的变化受毛霉菌丝体的生长影响，在12 h左右物料表面已均匀布满菌丝体，故其变化规律不甚明显.由表5看出：对照组处理在48 h时已测不出硬度和弹性等指标，表面光亮，30%压缩已完全无法回弹，腥臭味较浓烈.从TPA看，毛霉固态发酵产酶和菌膜形成与腐乳相似度都非常高.

表5 毛霉发酵鱼糜过程中质构的变化Table 5 Texture profile analysis for fermentation fishes surimi by Mucor

3 结 论

实验选用添加剂、预处理及接种腐乳毛霉等工艺处理海产低值鱼糜，并进行固态发酵，综合考虑发酵过程中感官、水分含量、pH、总酸、氨基酸态氮、TVB-N和TPA等指标，发现鱼糜原料中添加食盐的质量分数1%、葡萄糖的质量分数2%、玉米淀粉的质量分数5%及大豆分离蛋白的质量分数10%，水的质量分数控制65%，培养条件控制在25℃，空气湿度不低于85%条件下，毛霉在发酵坯上生长状况较好，TVB-N较低，氨基酸态氮较高，为后酵储备了较高活力的蛋白酶和氨基酸类物质，由此确定鱼糜固态发酵阶段的工艺条件，为后续后酵过程奠定了基础，也为今后的海产低值鱼鱼糜加工工业提供了参考.

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Studies on the solid-state fermentation process and the biochemical dynamic variation of surimi

ZHAO Pei-cheng1，HAN Xiao1，DING Yu-ting1，NI Jia-lei1，WANG Li-juan1，MAO Hong－qian2
（1.College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China；2 Hangzhou Institute of Product Quality Metrology Technology Supervision，Hangzhou 310019，China）

To improve the characteristics，and to increase the use of low-value sea fish surimi，the study on solid-state fermentation conditions of surimi by Mucor（XH-22）through single factor experiment and orthogonal experiment，and the observation of the changes in biochemical index and texture parameters during the processing are conducted.The result shows that the best activation time of mucor is 16h，the original moisture content of surimi is 65%，the content of NaCl is 2%，the glucose is 1%，the sucrose is 3%，the corn starch is 5%，the SPL（soybean protein isolated）is 10%，the cultivation temperature is 25 ℃，the cultivation time is 48 hour.Through the determination of moisture content in solid fermentation process，as well as pH，total acid，ANN，TVB-N，protease vigor and texture changes，the mechanism of solid-state fermentation process is revealed.

fermented bean curd；surmi；Mucor；solid-state fermentation

TS254.1

A

1006-4303（2013）02-0165-06

2012-03-06

国家863计划基金资助项目（2012AA092301）

赵培城（1963—），男，江苏芜湖人，副教授，硕士生导师，研究方向为食品生物技术，E-mail：zhpch＠zjut.edu.cn.

book=41,ebook=276

（

陈石平）