鸡胚背根神经节神经元在体内培养的研究

2013-08-20陆兆丰

中国实用神经疾病杂志 2013年5期

李力陆兆丰沈凌

河南科技大学第一附属医院神经外科洛阳 471000

神经细胞体外培养的方法已趋成熟，但体内培养的神经细胞在结构和功能上更接近体内生长的神经细胞。鸡胚绒毛尿囊膜层是天然的培养基［1－2］，将孵化13～15d的鸡胚背根神经节神经元种植于正在孵化的鸡胚的绒毛尿囊膜层，使神经细胞的培养环境得到进一步改善，从而提高神经细胞生长、分化及再聚集并发育成正常神经网络组织的成功率。

1 材料及方法

1．1 种蛋的选择及消毒选择表面清洁、蛋壳均质、蛋形规范、质量50～60g、气室、气孔均匀受精鸡胚；种蛋用温水清洗、擦干，于1∶1 000新洁尔灭液中浸泡3min后擦干放入消毒蛋托备用；蛋托采用废弃的经消毒的六孔培养板。

1．2 鸡胚培养种蛋置于（37．8±0．5）℃、相对湿度65%～70%环境的恒温二氧化碳培养箱中孵育，转蛋2次／d。将孵育13～15d的种蛋作为供体，孵育3～5d的种蛋作为载体。

1．3 鸡胚开窗孵育3～5d时，将鸡蛋在超净台中先用安尔碘擦拭，再用75%乙醇擦拭消毒。用无菌砂轮在鸡胚的气室极打磨出一个直径1．5～2．0cm的圆形窗口，用无菌镊子轻轻揭去蛋壳及附着的部分卵壳膜，暴露卵壳膜的下半部分。用无菌注射器在下半部分卵壳膜与蛋壳交界处（此处的卵壳膜与下面的尿囊膜之间有一小空隙）注射约0．1mL的PBS，使卵壳膜与尿囊膜分离，然后用镊子从分离处轻轻揭去卵壳膜，暴露鸡胚绒毛尿囊膜层。

1．4 鸡胚背根神经节神经元的制取［3－4］及培养［5］取孵化13～15d的鸡胚，用75%酒精消毒蛋壳，并从气室端磨开，无菌取出胚胎，放入4℃PBS液中反复清洗后，固定于无菌解剖板上，迅速剪开腹部皮肤并清除腹腔内脏器，在解剖显微镜下切除腹部椎板，暴露椎管内的脊髓，并小心将脊髓从椎管内提出。背根神经节（DRG）呈串珠样位于脊髓的两侧。逐个摘除脊髓两旁的DRG，并尽量剥除神经节表面的筋膜，放入35mm培养皿中，眼科剪将神经节剪至1mm3大小的碎块后移入4mL 0．25%胰蛋白酶内，37℃消化40min，1 000r／min离心5min，吸除胰酶消化液，加入FBS液终止消化。1 000r／min离心5min，吸除FBS液换入常规培养基，将其制成单细胞悬液，细胞计数后，按1×1 000 000／mL用微量加样器吸取0．1mL的细胞悬液接种于鸡胚绒毛尿囊膜层，然后用无菌的透明胶带将窗口覆盖。再将鸡胚放入恒温箱中继续孵育。每天通过透明胶带可直接观察鸡胚的存活情况及移植细胞的情况并定期行病理检查。

2 结果

病理检查显示，在载体的鸡胚绒毛尿囊膜层培养3～5d时，可观察到神经细胞存活（如图1）。在载体的鸡胚绒毛尿囊膜层培养6～9d时，可观察到神经细胞生长（如图2）。在载体的鸡胚绒毛尿囊膜层培养11～13d时，可观察到神经网络形成（图3、图4）。

3 讨论

体内培养的神经细胞在结构和功能上更接近体内生长的神经细胞。鸡胚绒毛尿囊膜（chick chorioallantoic membrane，CAM）法简单、方便、价格便宜、观察指标明确，是目前国内外较常用组织细胞培养模型，鸡胚孵化至第8天时，胚膜和血管网的发育已趋稳定，而机体免疫系统尚未完全建立，此时对各种异物几乎不产生排斥反应。受精鸡胚是一种干细胞，只有在适宜的外界环境中（如温度、湿度、氧饱和度等），才能发育成个体，而鸡胚外液即鸡胚绒毛尿囊膜层（鸡蛋清）是一种合适的天然“培养基”，具有以下优点［2－4］：（1）指标易于观察；（2）移植物成活率高；（3）取材简单，接种简单，条件要求低；（4）移植物生长快，实验周期短；（5）价格低，经济实用，可同时进行大样本实验观察。作者将摘取的鸡胚背根神经节制成单细胞悬液种植于正在孵化的鸡胚绒毛尿囊膜层培养，使神经细胞的培养环境得到进一步改善，从图1～4可以看将鸡胚背根神经节神经元移植于绒毛尿囊膜层培养，DRGn能在鸡胚绒毛尿囊膜层生长、分化及再聚集并发育成正常神经网络组织。为背根神经节神经元的研究和脑、脊髓等神经组织损伤后的修复、功能恢复和基层医院及医学教学提供一种易于观察、取材方便、价格低、实验周期短、经济实用的干细胞内培养方法［6－7］。