乙型肝炎病毒感染与肝星状细胞的活化增殖*

张 宁 综述 黄 坚 审校

在各种慢性肝脏疾病进展过程中，由于肝内纤维生成与降解失衡，致使过多的细胞外基质在肝内沉积，导致肝纤维化形成，常伴有炎症并可发展为肝硬化。其中，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化增殖是肝纤维化发生的中心环节[1]。在各种致病因素中，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染与肝纤维化的发生密切相关。众所周知，HBV可以通过炎症反应间接作用于HSC促进肝纤维化的发生，但是在肝脏无明显炎症坏死的病人中也会有纤维化的发生，提示HBV可以直接促进HSC的活化增殖。最近有关HBV感染导致肝纤维化发生机制的相关研究发现，HBV可直接作用于HSC在肝纤维化发生过程中发挥作用。本文就肝纤维化发生过程中HBV对HSC间接与直接作用的最新研究进展进行综述。

一、HBV感染与HSC的活化增殖

以往认为在慢性HBV感染过程中，各种致肝损伤的因素引起肝脏胶原沉积，从而导致肝脏纤维化，其中炎症以及免疫等因素发挥着重要的作用。这些患者血清炎性因子分泌增加，转氨酶水平升高。例如，Ying等[2]的研究中发现，慢性HBV感染的病人，其肝脏炎症以及纤维化程度在血清谷氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）与门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST)比值升高者更加明显。但是在一些慢性HBV感染的患者中，其血清（转氨酶）和组织学指标（肝穿刺病理检查炎症分级）并未显示出明显的肝脏炎症坏死，若干年后也进展为肝纤维化甚至肝硬化。

近年研究也发现，ALT持续正常的慢性HBV感染者中，部分患者的肝组织也会有不同程度的纤维化或炎症表现：Seto等[3]对乙型肝炎病毒e抗原（hepatitis B virus e antigen，HBeAg）阳性病人的研究发现，40例ALT持续正常者，其中9例（22.5%）有明显的组织学异常；Lai等[4]的研究中，59例ALT持续正常者，有37%的患者有显著的纤维化或炎症表现。并且，在以上HBeAg阴性病人的研究中显示，血清ALT持续正常者，高水平的血清HBV DNA与肝脏纤维化程度相关[3，4]。

以上研究表明，在慢性HBV感染相关的肝纤维化中，肝细胞虽然没有明显的受损（临床表现为血清ALT正常），但是肝脏仍然有不同程度的纤维化发生，并且纤维化的程度与血清中高水平的HBV DNA明显相关。HBV是否可以直接作用于肝星状细胞促进肝纤维化尚且有待研究。

在慢性HBV感染病人治疗与随访过程中，主要使用血清HBV DNA水平、血清ALT/AST比值等对患者进行监测，并且可以结合肝穿的组织病理学结果对疾病阶段进行评估。除以上临床水平的研究之外，我们还应该对肝纤维化的发生机制进行更加深入的研究。

二、HBV作用于HSC的机制

目前的研究认为，许多致肝脏慢性损伤的因素可能均是通过相似的机制导致肝纤维化的形成，最广为接受的是Friedman等提出的肝星状细胞（HSC）激活理论[5]。在各种致肝损伤因素的作用下HSC激活，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积，肝纤维化形成。多年来人们认为HBV感染后HSC的激活过程可能也是如此，但HBV致肝纤维化发生的确切机制尚不清楚。目前的研究认为，HBV可以间接或直接作用于HSC促进肝纤维化的发生。

（一）HBV间接作用于HSC HSC在慢性HBV感染所致肝纤维化的过程中发挥重要的作用。宿主遗传因素以及病毒基因变异等因素对HSC作用的发挥有明显的影响。并且，HBV与机体免疫系统的相互作用以及其所导致的肝脏炎症坏死等相关因素也会对肝纤维化进展造成明显的影响。

研究显示，在慢性HBV感染的病人中，肝脏纤维化程度与宿主基因的多态性相关。例如，白细胞介素-28（interleukin-28，IL-28）基因-251多态性与肝硬化的发生明显相关，其中TT基因型为易感基因，AA基因型为保护基因[6]；雌激素受体（estrogen receptor，ER）基因的多态性与HBV所致的肝硬化相关，P基因为易感基因，p基因为保护基因；谷胱甘肽S转移酶基因多态性（M1、P1和T1）与HBV引起的疾病进展相关，并且由于基因型M1与P1型的差异，活化的HSC在消除脂质过氧化反应时的能力不同[7]。

在慢性乙肝病毒感染的过程中，HBV基因组的高变异率与疾病的进展（发展为肝硬化与肝细胞癌）明显相关[8]。HBV的各种蛋白在肝纤维化进展过程中发挥着重要的作用，编码病毒蛋白的病毒基因组不同区域与肝纤维化、肝细胞凋亡以及导致肝损伤的通路密切相关。

许多研究认为，炎症因素在纤维化发生过程中发挥着重要的作用[1，5]。HBV与机体免疫系统的相互作用造成肝脏炎症和细胞坏死，多种细胞释放炎症因子，激活HSC发生表型转化，启动肝纤维化过程[1]。动物实验相关数据以及慢性HBV感染病人的临床研究表明，炎症相关的细胞因子在纤维化形成过程中发挥着重要的作用。炎症相关细胞因子包括前炎症细胞因子以及抗炎症因子，其中前炎症因子包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β），抗炎因子如白细胞介素 -10（interleukine-10，IL-10），编码这些细胞因子基因的多态性与纤维化进展明显相关。

免疫功能紊乱是急慢性肝损伤的主要原因，其中T细胞、B细胞、Kupffer细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK细胞）以及自然杀伤T细胞（natural killer T cell，NKT细胞）等免疫细胞在肝纤维化的免疫学发病机制中具有重要的作用[9]。研究表明，HBV转基因小鼠的肝脏NKT细胞可以直接激活HSC，并且NKT细胞分泌的IL-4和IL-13在HSC活化过程中发挥着重要的作用[10]。在慢性乙型肝炎与肝硬化病人中，IL-17以及IL-17活化的单核细胞可以促进HSC的激活，从而促进疾病的进展；外周血以及肝内辅助性T细胞17（T helper cell 17，Th17）的增加通过诱发HSC激活促进疾病进展[11]。在HBV相关的肝纤维化过程中，具有抗炎作用的调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg细胞）与具有促炎作用的Th17细胞对肝损伤以及HSC的影响是相反的[12]。除此之外，补体是肝脏免疫调节过程中重要的免疫调节剂，在慢性肝脏疾病的发病机制中有重要的作用。在慢性乙肝病毒感染的病人中，补体C5a与表达C5a受体的HSC相作用可以促进纤维化的形成[13]。

上述研究表明，在慢性HBV感染过程中，HBV可以间接作用于HSC，其中宿主遗传因素、HBV基因的变异对其有明显的影响，肝脏炎症以及免疫学等因素也发挥着重要的作用。

（二）HBV直接作用于HSC 在丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的研究中发现，HCV的基因以及其蛋白成分对HSC具有一定的直接作用。在大鼠原代肝星状细胞与稳定表达HCV核心蛋白的 HepG2细胞系（HepG2-HCV core cell line）的体外共培养体系中发现，HCV核心蛋白可以促使HSC的状态和数目发生改变，引起ECM的变化，加重炎性浸润和损伤，促进肝纤维化进展[14]。该研究可以提示嗜肝病毒及其蛋白成分可能对HSC有直接影响。

乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒，它选择性的在肝细胞内进行大量复制并释放病毒颗粒和病毒蛋白等成分。HBV除通过损伤肝实质间接引起肝纤维化，还可以通过直接作用于HSC而引起肝纤维化的发生。

Liu等[15]的研究发现，在体外的细胞共培养中，HBV与乙型肝炎病毒表面抗原（hepatitis B virus surface antigen，HB-sAg）可以影响人肝星状细胞（LX-2细胞）的增殖，并且HBV可以短暂的感染LX-2细胞、在其中复制表达HBs以及乙型肝炎病毒核心蛋白（hepatitis B virus core protein，HBc），还可以显著增加LX-2细胞Ⅰ型胶原信使RNA（mRNA）以及蛋白质的表达。该研究中通过免疫电镜技术观察到，HBV可以感染LX-2细胞，但是HBV并不能在LX-2细胞中持久的复制以及合成包膜蛋白等物质，可能因为肝星状细胞并不是HBV最适宜的宿主细胞，认为HBV对LX-2细胞的作用不是通过感染实现的[15]。王宇等[16]的研究发现，在体外培养的LX-2细胞，只有少量细胞中可以检测到HBV DNA，每个细胞中均在0.05拷贝以下，在所有LX-2细胞中未检测到共价闭合环状 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）；用Southern blot和Northern blot方法未检测到LX-2细胞中存在HBV复制中间体及mRNA，此项研究中未发现HBV感染肝星状细胞的证据。Wu等[17]的研究发现，HBV可以直接促进LX-2细胞TGF-β1及其下游信号转导分子的表达，HBV可以促进LX-2细胞Ⅰ型胶原的合成，且这一效应主要通过P38MAPK途径介导。这些结果表明，HBV虽不能感染肝星状细胞，也不能在其中复制，但是可以通过直接作用于肝星状细胞促进肝纤维化的发生。这为解释临床慢性HBV感染患者肝纤维化或肝硬化的发生与病毒滴度呈正相关提供了一定的实验依据。但是该研究中所使用的是LX-2细胞，为活化的HSC细胞系，因此HBV对静止期HSC的直接作用还不清楚，有待于建立HBV直接作用于HSC细胞的、更接近生理状态的模型，进一步的阐明HBV对HSC的直接作用。

Bai等[18]的研究发现，HBV颗粒、c蛋白以及x蛋白（hepatitis B virus x protein，HBx）可以促进 LX-2细胞增殖，并且可以增加血小板源性生长因子-B（Platelet Derived Growth Factor-B，PDGF-B）、PDGF受体 -β（Platelet Derived Growth Factor Receptor-β，PDGFR-β）、Ⅰ型胶原以及α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）mRNA的表达，并且PDGFR-β的磷酸化增加。但是PDGF-B、PDGFR-β蛋白水平没有明显改变。该研究表明HBV颗粒、c蛋白以及x蛋白在体外可以促进LX-2细胞增殖、促进纤维化形成，并且PDGF-B/PDGFR-β信号通路在此过程中发挥着重要的作用。

HBV的基因组包括四个开放读码框，可以编码HBsAg、HBV核心蛋白、反转录DNA聚合酶以及HBx蛋白。但是在HBV促进肝纤维化的发生机制中，哪种成分可以导致HSC分裂增殖、肝脏胶原沉积尚不清楚[19]。

研究表明，HBx的生物学功能是多样的，能够通过调节许多信号通路改变细胞的功能。它在病毒复制以及肝细胞癌的发生过程中发挥着重要的作用，并且在肝纤维化形成过程中，表达HBx蛋白的肝细胞分泌TGF-β增加，进而导致HSC的激活以及细胞分裂增加[20]。

一项研究中，LX-2细胞与稳定表达HBx蛋白的细胞系（QSG7701-HBx）的体外共培养模型中发现，HBx可以直接引起HSC增殖，并且上调纤维化相关分子的表达，例如α-SMA、TGF-β1、结缔组织生长因子以及转化生长因子β受体Ⅱ[19]。

包括HBx在内的其它HBV蛋白在肝纤维化过程中的作用需要进一步的研究，以发现HBV是否可以直接作用于肝星状细胞，并且发现是哪种HBV相关蛋白在其中发挥的作用。

Winau等[21]的研究认为，肝星状细胞具有抗原提呈作用，提示HSC表面具有可以识别、捕获抗原分子靶位的位点。因此认为HBV可能通过特异或非特异性粘附作用接触LX-2细胞表面，从而刺激细胞发生功能改变，进而促进肝纤维化的发生。这也提示HBV可以直接作用于肝星状细胞。

[1]Lee UE，Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2011，25（2）:195-206.

[2]应若素，杨湛，陈燕宇，等.丙氨酸氨基转移酶水平正常与轻度升高慢性HBV感染者的肝脏病理学特征比较.中华肝脏病杂志，2012，20（8）：585-588.

[3]Seto WK，Lai CL，Ip PPC，et al.A large population histology study showing the lack of association between ALT elevation and significant fibrosis in chronic hepatitis B.PLoS One，2012，7（2）:e32622.

[4]Lai M，Hyatt BJ，Nasser I，et al.The clinical significance of persistently normal ALT in chronic hepatitis B infection.J Hepatol，2007，47（6）:760-767.

[5]Jiao J，Friedman SL，Aloman C.Hepatic fibrosis.Curr Opin Gastroenterol，2009，25（3）:223-229.

[6]Qin X，Deng Y，Liao XC，et al.The IL-8 gene polymorphisms and the risk of the hepatitis B virus/infected patients.DNA Cell Biol，2012，31（6）:1125-1130.

[7]Mohammadzadeh Ghobadloo S，Yaghmaei B，Allameh A，et al.Polymorphisms of glutathione S-transferase M1，T1，and P1 in patients with HBV-related liver cirrhosis，chronic hepatitis，and normal carriers.Clin Biochem，2006，39（1）:46-49.

[8]Kitab B，Essaid El，Feydi A，et al.Variability in the precore and core promoter regions of HBV strains in morocco:characterization and impact on liver disease progression.PLoS One，2012，7（8）:e42891.

[9]Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis.Gastroenterology，2008，134（6）:1655-1669.

[10]Jin Z，Sun R，Wei H，et al.Accelerated liver fibrosis in hepatitis B virus transgenic mice:Involvement of natural killer T cells.Hepatology，2011，53（1）:219-229.

[11]Sun HQ，Zhang JY，Zhang H，et al.Increased Th17 cells contribute to disease progression in patients with HBV-associated liver cirrhosis.J Viral Hepat，2012，19（6）:396-403.

[12]Li J，Qiu SJ，She WM，et al.Significance of the balance between regulatory T（Treg） and T helper 17（Th17） cells during hepatitis B virus related liver fibrosis.PLoS One，2012，7（6）:e39307.

[13]Xu R，Lin F，He J，et al.Complement 5a stimulates hepatic stellate cells in vitro，and is increased in the plasma of patients with chronic hepatitis B.Immunology，2012，Oct（Epub ahead of print）.

[14]Shin JY，Hur W，Wang JS，et al.HCV core protein promotes liver fibrogenesis via up-regulation of CTGF with TGF-beta1.Exp Mol Med，2005，37（2）:138-145.

[15]Liu X，Zhu ST，You H，et al.Hepatitis B virus infects hepatic stellate cells and affects their proliferation and expression of collagen type I.Chin Med J（Engl），2009，122（12）:1455-1461.

[16]王宇，刘天会，贾继东，等.乙肝病毒感染肝星状细胞的体外研究. 首都医科大学学报，2009，30（3）：1006-7795.

[17]Wu X，Wang Y，Cui Y，et al.Hepatitis B virus directly promotes collagen I expression of LX-2 cells without infection in vitro.Hepatol Res，2012，42（9）:911-921.

[18]Bai Q，An J，Wu X，et al.HBV promotes the proliferation of hepatic stellate cells via the PDGF-B/PDGFR-beta signaling pathway in vitro.Int J Mol Med，2012，30（6）:1443-1450.

[19]Guo GH，Tan DM，Zhu PA，et al.Hepatitis B virus X protein promotes proliferation and upregulates TGF-beta1 and CTGF in human hepatic stellate cell line，LX-2.Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2009，8（1）:59-64.

[20]Martín-Vílchez S，Sanz-Cameno P，Rodríguez-Munoz Y，et al.The hepatitis B virus X protein induces paracrine activation of human hepatic stellate cells.Hepatology，2008，47（6）:1872-1883.

[21]Winau F，Hegasy G，Weiskirchen R，et al.Ito cells are liverresident antigen-presenting cells for activating T cell responses.Immunity，2007，26（1）:117-129.