知母多酚对血管内皮的保护作用

刘翠华

隆回县人民医院药剂科 422200

知母为百合科植物知母(Anemarrhena asphode-loides Bunge)干燥的根茎，《神农本草经》中记载百合性苦寒，具有滋阴降火、润肠滑燥、除烦止渴、利小便的作用。现代药理研究发现，知母中主要含有甾体皂苷、双苯吡酮类，另有木脂素类、黄酮类、多糖类、有机酸类等，具有抗炎解热、抗血小板聚集、降脂抗动脉粥样硬化等功效，其主要活性成分为知母多酚［1］。动物体内试验表明［2］，知母多酚可显著降低血糖水平，保护血管内皮，改善心血管并发症。本文通过知母多酚对大鼠离体胸主动脉功能的影响，探讨其对血管内皮的保护机制。

资料与方法

实验材料:药物与试剂:知母购于安徽亳州药材市场，药材批号:2011056，正丁醇(天津市达森制剂)，以芒果苷(上海同田生物有限公司生产，纯度99.8%)为对照品;棕榈酸，牛血清白蛋白(BSA)、胰岛素注射液(上海第一生化药业有限公司生产，批号:1105244)，重酒石酸去甲肾上腺素注射液(远大医药有限公司);乙酰胆碱(Ach)、水杨酸钠、D-葡萄糖、果糖、叠氮钠均为分析纯。

实验动物:雄性SD大鼠，购自北京实验动物研究中心，合格证编号:0002461;动物采用分笼饲养，保持室温21℃ ±3℃。

仪器:JH-2型肌张力传感器、HW-400E恒温平滑肌槽、BL-420F型生物机能实验系统，RF-5301PC型岛津荧光分光光度计。

统计学分析:测量数据采用SPSS19.0进行分析，以表示，采用单因素方差分析和t检验进行统计学分析，P＜0.05有统计学差异。

实验方法:(1)知母多酚的提取:取20g知母药材适当粉碎，分别以10倍量和6倍量水煎煮2次，过滤，合并滤液浓缩至1g/ml，加乙醇至含醇量70%，回收乙醇得流浸膏，加水至0.5g/ml，先调pH值至3，正丁醇萃取3次，取正丁醇层，再调pH值至7，用水萃取3次，得水层，最后调pH值至3，正丁醇萃取3次，回收正丁醇，得知母多酚，收率为3.4%。⑵知母多酚与大鼠胸主动脉舒张反应:选取体重在150～200g的雄性 SD大鼠，剪头处理后迅速取出胸主动脉，将其置于K-H液中并通入95%O2和5%CO2的混合气体，分离血管周围组织，祛除血管中的血液，剪成长2～3mm血管环，固定于K-H液的浴皿中，通过张力换能器与生物机能记录仪连接。给血管环施加2g左右的静息张力，平衡1h后，加入高K+液，重复两次，检查标本活性，然后用K-H液洗涤至基线。待动脉环稳定后，先用1×10－6mol/L的NE收缩血管环，再用ACh累进剂量来舒张血管，待NE预收缩的血管舒张幅度＞80%时表示内皮完整。分组处理已平衡的主动脉环:①正常组:继续平衡1h;②棕榈酸损伤组:浴皿中加入0.1mmol/L棕榈酸温浴 30min;③知母多酚组:分别加入 0.01、0.1、0.3mg/mL 的知母多酚，30min后加入棕榈酸，观察其对血管张力的影响。在上述各组中依次间隔加入胰岛素10－6、10－5、10－4、10－3mmol/L，观察胰岛素诱导的舒张百分比。⑶知母多酚与体外糖基化修饰蛋白质:用PBS与BSA 0.5%、D-葡萄糖5mmol、果糖5mmol、叠氮钠0.02%配制反应液，将1.8mL反应液分装于2.0ml的 EP 管内，再分别加入0.1ml1 ×10－2、8 ×10－3、6 ×10－3、4×10－3、2×10－3、1×10－3g/L 的知母多酚，将试管密封，在37℃下培育21d，形成糖基化修饰的白蛋白(AGE-BSA)，以盐酸氨基胍为阳性对照，另加空白糖基化系统、无蛋白的空白组、无糖空白组，每组设4个复孔。采用荧光光谱分析法，在激发波长370/发射波长450nm测定其吸收光谱，计算AGE-BSA含量。结果以荧光值表示，组间采用t检验。

结果

知母多酚对大鼠胸主动脉舒张反应的影响:经不同浓度知母多酚预处理后，可明显改善受胰岛素调节的内皮依赖性血管舒张，其中高剂量组与棕榈酸损伤组比较有显著差异(P＜0.05)，表明知母多酚可保护血管内皮，且作用程度与浓度呈梯度依赖性。

知母多酚对体外糖基化修饰蛋白质的抑制:实验表明阳性对照氨基胍盐酸盐的抑制率为76.22%;知母多酚(10－2g/L)的抑制率高达98.97%，说明知母多酚能显著抑制体外生成糖基化产物。

讨论

知母多酚对血管内皮的作用:内皮细胞中L-精氨酸可在酶的作用下释放的NO，NO经扩散与细胞膜上的鸟苷酸环化酶结合后激活环化鸟苷酸(cGMP)，从而舒张血管平滑肌。适当浓度的胰岛素可促进一氧化氮合酶(eNOS)的表达，促进NO的释放;此外，胰岛素可经蛋白激酶(MAPK)途径刺激分泌内皮素(ET)-1，并促进E-选择素的表达，从而随机体适应性的调节血管的舒缩反应［3］。本实验棕榈酸的作用是刺激大鼠主动脉环，降低胰岛素介导的主动脉舒张作用。对于棕榈酸损伤VEC依赖性血管舒张功能和减少内源性NO释放，知母多酚能够显著改善。

蛋白质非糖基化:体内还原糖与蛋白质中氨基结合形成可逆的Shiff氏碱中间体，进而形成稳定可逆的蛋白复合物1-氨基-1-脱氧-D酮搪(Amadori)，Amadori产物及其降解的羰基化合物与游离氨基反应生成具有荧光性的不可逆终产物AGEs，据研究表明，AGEs可灭活血管松弛因子，进而阻碍了NO介导的内皮细胞依赖性血管舒张，导致血管痉挛［4］。本实验结果表明知母多酚可明显抑制糖基化蛋白的生成。

1 Li Hua，Hongliang Li，Yige Bao，et al.Free fatty acids induce en-dothelial dysfunction and activate protein kinase C and nuclear fac-tor-κB pathway in rat aorta［J］.International Journal of Cardiology，2010:1-7.

2 Pramanik S，Das AK，Chakrabarty M，etal.Efficacy of alternate-day versus everyday dosing of atorvastatin［J］.Indian J Pharmacol，2012，44(3):362-365.

3 Yamagishi S.Role ofadvanced glycation end products(AGEs)and receptor for AGEs(RAGE)in vascular dam-age in diabetes［J］.Exp Gerontol，2011，46(4):217-224.

4 师怡，林建银.基质金属蛋白酶抑制剂与肿瘤的相关性研究新进展［J］.当代医学，2009(6):12-14.