人骨髓间充质干细胞成骨诱导的研究进展

李翰翔，丁晓玲，徐茂义，沈忠飞 (嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001)

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下可分化为多种功能细胞，根据发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞。骨髓间充质干细胞(Bone marrow－derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是骨髓基质系统中的一类多能干细胞，具有向中胚层和神经外胚层来源组织细胞分化的能力。BMSCs获取简便，分离培养较容易，移植排斥反应较弱，植入反应较为理想。哺乳动物来源的BMSCs是具有多向分化潜能的成体干细胞，相关研究证实其有强烈的成骨潜能［1］，因此BMSCs被认为是一种理想的骨组织工程种子细胞，其成骨诱导成为近来研究的热点。

1 BMSCs的特性及分化潜能

1.1 BMSCs的生物学特性:间充质干细胞(MSCs)来源于中胚层，主要存在于器官间质和结缔组织中，在骨髓组织中含量最多，统称为骨髓间充质干细胞(BMSCs)。BMSCs具有成体干细胞的两个特征:一是能在很长一段时间内准确地自我复制，即长期自我更新;二是能分化为具有一定形态特征和特定功能的成体细胞，代替因疾病或损伤凋亡的细胞，在一定程度上维持细胞的动态平衡。此外，BMSCs还具有异质性、贴壁性、可移植性和快速克隆的能力［2］。BMSCs细胞表面可表达CD29、CD44、CD90、CD124等，其中粘附分子 CD44是多种配体的受体，其分别在骨和骨髓中对构建细胞外基质起重要作用，BMSCs对CD44的强表达表明其在骨髓中有助于骨髓基质的形成和功能的发挥。但BMSCs的抗原表型不具有特异性，在肌肉细胞、间质细胞和内皮细胞表面均可找到同类抗原。有研究显示BMSCs在传代培养时保持着细胞的端粒活性和染色体核型［3］，表现出高度扩增能力。BMSCs在形态学上主要表现为梭形、多角形和纺锤形，包括体积较大的成熟细胞，体积较小的无颗粒细胞和颗粒细胞共三个细胞亚群。

1.2 BMSCs的分化潜能:有学者认为BMSCs最重要的生物学特性是多向分化潜能，大量体外实验表明BMSCs可分化为骨、骨髓基质、软骨、肌肉、肌腱、韧带和脂肪等多种间充质组织［4］。Kadiyala等［5］将BMSCs在体外扩增后置于羟基磷灰石上培养，细胞产生骨基质并向骨细胞分化。有研究证实BMSCs还具有向心肌细胞及神经元样细胞分化的潜能。Tomita等［6］向低温造成心肌梗死的动物模型的心肌瘢痕组织中注射大鼠骨髓细胞，移植细胞在5 w后分化出了肌管，并且表达了肌球蛋白重链和肌钙蛋白，提示BMSCs已向心肌细胞分化。更为重要的是在移植细胞和宿主细胞间存在间隙连接蛋白connexin－43，表明二者间有缝隙连接形成［7］，这一结构证明BMSCs具有依赖环境的定向分化能力。细胞周期研究显示，大多数BMSCs处于G0/G1期(约90%)，只有少数细胞正在活跃地复制，高比例的G0/G1期细胞暗示BMSCs具有高度分化潜能。

2 BMSCs的分离和培养

BMSCs最易从骨髓中分离获取，但其含量不高，在全骨髓中的比例约为1∶1×105，且细胞数量随体质的衰弱或年龄的增加而逐渐减少［8］。因此，在离体条件下将 BMSCs进行分离、纯化和扩增十分重要。筛选BMSCs的方法在Friedemtein法基础上经过改良，主要有3种方式:①贴壁筛选法:利用造血细胞在培养瓶中呈悬浮生长而BMSCs呈贴壁生长的特性，即底物黏附特性将二者分离。②密度梯度离心法:利用BMSCs与其他细胞的密度差异，采用Fieoll液或Pereoll液将其分离出来。③免疫学分离法:采用免疫磁珠法或流式细胞仪法，依据细胞表面标志物和细胞特性进行筛选。

培养BMSCs最常用的是DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)培养基(含有10% ～20%的胎牛血清 FBS，100 U/ml链霉素，100 U/ml青霉素)。Lennon 等［9］发现适量的胎牛血清有利于维持BMSCs的贴壁、扩增及多系分化潜能，10%的胎牛血清最有利于BMSCs的培养，浓度过高时容易使细胞过早老化。培养所采用的细胞密度一般为5×105/ml。BMSCs可以反复传代，传代细胞能保持多向分化潜能，不发生自然分化，传代后的BMSCs细胞纯度可达到95%［10］。有学者尝试用新的方法来分离培养 BMSCs，Encina等［11］用抗STRO－1包被的免疫磁珠从人的骨髓基质中分离培养BMSCs，其中98%的细胞分化为成骨细胞。Oreffo等［12］采用Hop－26选择性分离培养人骨髓基质细胞，在Hop－26阳性细胞中发现大量呈典型成纤维细胞样的细胞克隆。

3 BMSCs的成骨诱导

自BMSCs被发现起，多数都是对其向骨组织分化的研究，决定BMSCs分化方向的关键则是诱导分化的条件［13］。刺激 BMSCs向成骨细胞分化的物质有许多［14－15］，如 TGF－β、BMP、IGF－1等。目前BMSCs成骨定向诱导分化的方法有以下几种:

①化学诱导:是目前最常用方法，经典培养体系中含地塞米松、β－甘油磷酸钠和抗坏血酸，可诱导人BMSCs定向分化为典型成骨细胞，此种细胞碱性磷酸酶活性较高，能产生I型胶原，分泌骨连接素和骨桥素。地塞米松可刺激碱性磷酸酶活性，诱导成骨分化［16］。Ogston等［17］发现地塞米松浓度在10－8mol/L这一浓度级别具有较高的成骨诱导效率。β－甘油磷酸钠可为成骨细胞提供磷离子，促进钙盐沉积。抗坏血酸能促进胶原合成，刺激碱性磷酸酶和ATP酶活性。

②中药诱导:淫羊藿、柚皮苷、黄芪、龟甲等可单独或与化学培养液共同发挥作用诱导BMSCs分化为成骨细胞。

③成骨细胞诱导:通过成骨细胞与BMSCs共同培养，以直接接触的方式调节破骨细胞融合和增殖，实现成骨诱导。

④物理诱导:采用电磁场、体外冲击波等物理机械刺激，通过MAPK通路使BMSCs向成骨细胞分化。Wang等［18］发现低能量冲击波可激活BMSCs内网状激活系统，诱导TGF－β1的产生，最终诱导骨小结形成。Takahashi［19］发现冲击波作用可促使成骨细胞表达细胞外基质蛋白的相关基因，这种蛋白对于促进成骨起重要作用。

⑤转基因诱导:向靶细胞内转入具有成骨作用的基因，该基因在病变区转录为mRNA并翻译为成骨相关蛋白，诱导自身成骨。

4 BMSCs成骨特性鉴定

目前对于BMSCs成骨特性的鉴定尚无特异性手段，多采用以下方法:①采用光学显微镜进行形态学特性观察或采用扫描电镜对有载体依附的BMSCs进行细胞和组织形态学观察;②免疫组化检测Ⅰ型胶原;③Von Kossa′s矿化结节染色;④Gomori钙－钴法检测碱性磷酸酶;⑤原位杂交检测骨连接素和骨桥素;⑥MTT比色法测定细胞活性反应。

5 问题与展望

尽管BMSCs的相关研究已进行了几十年，也取得了一定进展，国外学者已建立了兔、鼠及人的BMSCs培养体系，并将其成功诱导为多种结缔组织。但BMSCs相关研究本身还不够全面和系统，目前仍处于探索阶段。据殷晓雪等［20］研究发现，人BMSCs经诱导可产生连续的矿化结节，而鼠MSCs在相同培养条件下产生的矿化结节呈岛状且不连续，与未矿化细胞群间隔分布，提示种属间的差异在BMSCs的研究中是不容忽视的，也表明从动物实验过渡到临床应用仍需进一步深入研究。同时，人们对BMSCs的分化机理尚未完全掌握，尤其是BMSCs的定向分化和制备过程不易调控。此外，对成骨细胞诱导分化的鉴定以及细胞与支架材料的融合等诸多问题仍有待人们去解决。

近年来，利用干细胞构建组织工程化骨组织成为生物研究领域的热点之一，其中的关键环节是获取大量的、活力和功能良好的种子细胞。实验表明，骨髓来源的MSCs分裂增殖能力强，分化潜能大，免疫排斥反应较弱，取材方便，无伦理问题的限制，且多次传代后成骨能力不会减弱，因此BMSCs很适合作为骨组织工程的种子细胞。同时，作为细胞表型分化尚不成熟的前体干细胞，BMSCs在同种异体移植后排斥反应也比较弱，是一种理想的替代治疗的靶细胞。随着相关研究的深入，BMSCs在细胞替代治疗和组织工程中有着广阔的应用前景。

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