硫化氢上调ABCA1表达促进泡沫细胞胆固醇流出的实验研究＊

李国术，何平平，王 波，周寿红，欧阳新平△

（1.衡阳市中心医院急诊科，湖南衡阳 421001；2.南华大学心血管疾病研究所／生理学教研室，湖南衡阳 421001；3.南华大学附属第一医院麻醉科，湖南衡阳 421001）

泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化（artherosclerosis，AS）重要的病理学基础，单核巨噬细胞吞噬修饰的低密度脂蛋白，特别是氧化修饰低密度脂蛋白（oxidized low－density lipoprotein，ox－LDL）而形成泡沫细胞［1］。肝外组织细胞中的胆固醇通过血液运输到肝脏，合成胆汁排出体外，称为逆向胆固醇转运（reverse cholesterol transport，RCT）。RCT能力的减弱是泡沫细胞形成的重要原因。三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ATP－binding cassette transporter A1，ABCA1）被称作RCT的“看门人”，发挥抗 AS作用［2］。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）被称为第3种气体信号分子，广泛分布于各系统中［3－4］。H2S能延缓AS的进程，缩小AS斑块，具有抗AS作用［5］。本研究旨在观察H2S对泡沫细胞胆固醇流出和ABCA1表达的影响，探讨H2S抗AS的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与分组 RAW264.7细胞购自中科院上海细胞库。细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中。细胞融合60%～70%时，ox－LDL（50μg／mL）孵育48h，转变成泡沫细胞。实验分为泡沫细胞组、硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS）（10－5、10－4和10－3mol／L）处理0、12、24和48h组。

1.2 方法

1.2.1 试剂及仪器 NaHS购自Sigma公司。［3H］标记的胆固醇（原子能院同位素所）。ABCA1兔抗鼠一抗以及辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗购自Santa Cruz公司。MMLV第一链cDNA合成试剂盒、总RNA提取试剂盒和Hot Star Taq Master Mix试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2.2 胆固醇流出检测 对数生长的细胞，浓度为3.0×106个／mL，接种6孔板，含10%胎牛血清、0.2μCi／L［3H］标记的胆固醇和ox－LDL（50μg／mL）的培养液共敷育48h。H2S组用 NaHS（10－5、10－4和10－3mol／L）继续敷育12、24和48h。更换培养液，细胞在无血清含50μg／mL载脂蛋白AI的新鲜培养液中敷育12h，液闪仪检测培养液和细胞中的［3H］胆固醇浓度。胆固醇流出率用培养液中［3H］／总值［3H］（培养液＋细胞）×100%表示。

表1 H2S对泡沫细胞内FC及CE浓度的影响（n＝5）

表2 H2S对泡沫细胞内胆固醇流出的影响（，n＝5）

表2 H2S对泡沫细胞内胆固醇流出的影响（，n＝5）

a：P＜0.05，与泡沫细胞组比较；b：P＜0.05，与 NaHS（10－5 mol／L）组比较。c：P＜0.05，与 NaHS（10－4 mol／L）组比较；d：P＜0.05，与 NaHS处理0h比较。e：P＜0.05，与NaHS处理12h比较；f：P＜0.05，与 NaHS处理24h比较。

胆固醇流出率（%）组别0h 12h 24h 48h泡沫细胞组 13.46±1.76 14.39±2.06 15.15±1.94 17.82±2.25 NaHS（10－5 mol／L）组 13.79±1.54 14.26±1.84 17.69±2.17 20.43±3.14 NaHS（10－4 mol／L）组 14.21±1.13 15.51±1.64 28.91±3.65abde 36.80±1.13abdef NaHS（10－3 mol／L）组 14.68±1.79 16.37±2.12 42.77±4.21abcde 54.17±5.71abcdef

1.2.3 高效液相色谱检测 超声破碎细胞，BCA法蛋白定量。细胞裂解产物分成两份，一份测定游离胆固醇（free cholesterol，FC），加入等体积8.9mmol／L的KOH醇。另一份测定总胆固醇（total cholesterol，TC），加入等体积的15%KOH醇。两份样本加入6%三氯乙酸及等体积正己烷和异丙醇的混合溶液，1500r／min离心5min，收集上层有机相。加入100μL异丙醇、正庚烷和乙晴的混合溶液溶解样品。1500r／min离心5min，收集上清液进行高效液相色谱分析。采用C18柱，以异丙醇∶正庚烷∶乙晴为流动相进行非梯度洗脱，流速为1mL／min，216nm波长下检测，以峰面积定量胆固醇。胆固醇酯（cholesterol ester，CE）经胆固醇酯酶水解为胆固醇，测定TC量，TC量减去FC量为CE量，以mg／mg细胞蛋白为胆固醇和CE单位。

1.2.4 实时定量PCR检测 收集细胞，Trizol提取细胞的总RNA。提取的总RNA为模板进行逆转录反应，合成cDNA第一链。取cDNA样品梯度稀释，进行实时定量PCR反应，反应总体系为30μL，包含cDNA 4μL，上下游引物各1μL，dNTP Mix（2×）8μL。ABCA1引物：上游：5′－AGG AAA CCC AAT CCC AGA TAC CC－3′，下游：5′－GCT CGG AGG AAG TGC TTG AGA AT－3′。β－actin引物：上游：5′－CCA TCA TCT TGC AGG AGC G－3′，下游：5′－CTG GCA GTG AGC TAT ACT CG－3′。采用2－△△CT法处理数据。

1.2.5 Western blotting检测 提取细胞总蛋白，BAC法蛋白定量。100μL样本加入到2×SDS凝胶加样缓冲液中煮沸。凝胶电泳1h分离蛋白质，分离的蛋白转膜至聚偏氟乙稀膜上。10%脱脂牛奶封闭2h，加入兔抗鼠ABCA1和β－actin一抗，4℃下过夜。加入羊抗兔二抗，孵育6h。显影后进行半定量分析。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件进行统计分析，计量资料用表示，单因素方差分析后，组间差异比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 H2S对泡沫细胞内FC及CE浓度的影响 与泡沫细胞组相比，NaHS（10－4、10－3mol／L）处理24h或 NaHS（10－4mol／L）处理48h均显著降低了泡沫细胞中TC、FC和CE及CE／TC水平（P＜0.05）。NaHS（10－5mol／L）处理24h和NaHS（10－4mol／L）处理12h细胞中TC、FC和CE及CE／TC水平与泡沫细胞组相比差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

图1 H2S对泡沫细胞ABCA1蛋白表达的影响

表3 H2S对泡沫细胞ABCA1表达的影响（，n＝5）

表3 H2S对泡沫细胞ABCA1表达的影响（，n＝5）

a：P＜0.05，与泡沫细胞组比较；b：P＜0.05，与 NaHS（10－5 mol／L）24h组比较。c：P＜0.05，与NaHS（10－5 mol／L）24h组比较；d：P＜0.05，与 NaHS（10－4 mol／L）12h组比较；e：P＜0.05，与 NaHS（10－4 mol／L）24h组比较。

组别 ABCA1mRNA相对表达水平（%）ABCA1蛋白100.00±0.00 0.15±0.02 NaHS（10－5 mol／L）24h组 103.27±3.65 0.17±0.03 NaHS（－4 mol／L）24h组 125.76±5.14abd 0.48±0.05abd NaHS（－3 mol／L）24h组 148.63±8.36abc 0.98±0.12abc NaHS（－4 mol／L）12h组 105.38±2.47 0.16±0.02 NaHS（－4 mol／L）48h组 156.79±5.96ade 0.96±0.13相对表达水平泡沫细胞组ade

2.2 H2S对泡沫细胞内胆固醇流出的影响 与泡沫细胞组相比，NaHS（10－4、10－3mol／L）处理24和48h时间和浓度依赖的方式增加泡沫细胞胆固醇流出（P＜0.05）。NaHS（10－5mol／L）处理12、24和48h及 NaHS（10－5、10－4、10－3mol／L）处理12h没有影响泡沫细胞胆固醇流出（P＞0.05），见表2。

2.3 H2S对泡沫细胞ABCA1mRNA和蛋白表达的影响 与泡沫细胞组相比，NaHS（10－4和10－3mol／L）处理 24h或NaHS（10－4mol／L）处理48h均显著上调细胞中 ABCA1mRNA和蛋白表达（P＜0.05），呈时间和浓度依赖性。NaHS（10－5mol／L）处理24h及 NaHS（10－4mol／L）处理12h细胞中ABCA1的表达与泡沫细胞组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1和表3。

3 讨 论

AS发病机制十分复杂，至今尚未阐明。H2S具有改善血管内皮功能、调节平滑肌细胞凋亡和增殖、抑制血管重构、舒张血管和抗氧化等心血管保护作用［6］。研究表明H2S具有抗AS的作用，但机制没有完全阐明［7］。研究发现H2S可以延缓对ApoE基因敲除小鼠AS的进程，减小AS斑块［8］。本研究结果表明H2S降低了泡沫细胞内胆固醇和胆固醇酯的浓度，增加胆固醇的流出率。

在致病因素的作用下，单核巨噬细胞在血管内膜下吞噬过多的胆固醇和磷脂，特别是ox－LDL，以脂滴的形式聚集在细胞内形成泡沫细胞［9－10］。巨噬细胞摄取过多脂质并沉积于血管内膜下，本身是一种自我保护机制，关键是这些细胞摄取脂质后能否将其代谢并转运出去。细胞脂质摄取与流出的失衡是泡沫细胞形成的关键。ABCA1在巨噬细胞胆固醇流出和RCT的过程中发挥十分重要的作用［11］。研究发现H2S能下调巨噬细胞CD36mRNA和蛋白表达，减少ox－LDL摄取，抑制泡沫细胞形成［12］。那么H2S能否影响细胞RCT，而发挥抗AS的作用？本研究结果表明H2S以剂量和浓度依赖方式上调了巨噬细胞性泡沫细胞中ABCA1mRNA和蛋白的表达，并增加泡沫细胞中胆固醇流出。因此H2S抗AS的作用可能与通过上调泡沫细胞中ABCA1表达并促进胆固醇流出有关。

［1］Karper JC，Ewing MM，Habets KL，et al.Blocking tolllike receptors 7and 9reduces postinterventional remodeling via reduced macrophage activation，foam cell formation，and migration［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32（8）：e72－e80.

［2］饶春燕，乐湘华.硫化氢在炎症反应中的作用研究进展［J］.重庆医学，2012，41（6）：609－611.

［3］Martelli A，Testai L，Breschi MC，et al.Hydrogen sulphide：novel opportunity for drug discovery［J］.Med Res Rev，2012，32（6）：1093－1130.

［4］Chen Y，Zhao J，Du J，et al.Hydrogen sulfide regulates cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2＋uptake via K（ATP）Channel and PI3K／Akt pathway［J］.Life Sci，2012，91（7／8）：271－278.

［5］Zhang H，Guo C，Wu D，et al.Hydrogen sulfide inhibits the development of atherosclerosis with suppressing CX3CR1and CX3CL1expression［J］.PLoS One，2012；7（7）：e41147.

［6］Qiao W，Chaoshu T，Hongfang J，et al.Endogenous Hydrogen sulfide is involved in the pathogenesis of atherosclerosis［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，396（2）：182－186.

［7］Mani S，Li H，Untereiner A.Decreased endogenous production of hydrogen sulfide accelerates atherosclerosis［J］.Circulation.2013，127（25）：2523－2534.

［8］Wang Y，Zhao X，Jin H，et al.Role of Hydrogen sulfide in the development of atherosclerotic lesions in apolipoprotein E knockout mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2009，29（2）：173－179.

［9］Huang Z，Dong F，Li S，et al.Berberine－induced inhibition of adipocyte enhancer－binding protein 1attenuates oxidized low－density lipoprotein accumulation and foam cell formation in phorbol 12－myristate 13－acetate－induced macrophages［J］.Eur J Pharmacol，2012，690（1／2／3）：164－169.

［10］李华波.普伐他汀与罗格列酮联合作用对巨噬细胞ABCAl表达的影响［J］.重庆医学，2010，39（7）：777－779.

［11］Ma L，Dong F，Zaid M，et al.ABCA1protein enhances Toll－like receptor 4 （TLR4）－stimulated interleukin－10（IL－10）secretion through protein kinase A （PKA）activation［J］.J Biol Chem，2012，287（48）：40502－40512.

［12］Zhao ZZ，Wang Z，Li GH，et al.Hydrogen sulfide inhibits macrophage－derived foam cell formation［J］.Exp Biol Med（Maywood），2011，236（2）：169－176.