95%乙醇提取白胡椒中胡椒碱的工艺研究

石宝俊，高君泽，黄晓德，赵伯涛*

(1.南京野生植物综合利用研究院，江苏南京 210042;2.南京中医药大学 药学院，江苏南京 210046)

胡椒为胡椒科植物胡椒(Piper nigrum L.)的果实。当果穗基部的果实开始变红时，剪下果穗，晒干或烘干后，即成黑褐色，取下果实，通称黑胡椒。如全部果实均已变红时采收，用水浸渍数天，擦去外果皮，晒干，则表面里灰白色，通称白胡椒。

胡椒碱(C17H19NO3)为白胡椒的活性成分，具有抗肿瘤［1］、抗氧化［2］、抗消化系统溃疡［3］、抗抑郁［4］、抗免疫调节等作用［5］。刘文等［6］同时用酸水和75%乙醇进行提取胡椒碱，比较后发现pH值为3.5的酸水提取只比乙醇提取略低，认为乙醇的提取、回收成本较高，酸水提取更好。侯文洁等［7］则选择用甲醇提取胡椒碱，他们认为乙醇价格高，大规模生产成本较高，用水做提取价格便宜，但提取得到的水溶性成份多，后处理成本较高。选择甲醇为提取剂，所获得的提取率高，而且后期处理工艺相对简单。但是其有毒，工业生产不安全。用乙醇提取白胡椒时，随乙醇中含水量的增加，提取率增加，同时后续的操作如过滤和浓缩的难度也增加。故在提尽胡椒碱的前提下，采用无水乙醇和95% 乙醇使提取过程简化，提取效果较好;而比较二者，95%乙醇更适合［8］。另外，95%乙醇提取的黑胡椒油树脂得率最低［9］，后处理简单。本实验采用95%乙醇提取胡椒碱，用95%乙醇提取，蒸馏回收后的乙醇还是95%，可以循环使用。

1 材料

1.1 仪器

Agilent高效液相仪，紫外检测器;Agilent ZORBAX－C18柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，SF－400 电子天平(好又多电器有限公司)，旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂)，DW调温电热器(上海平环燃烧设备工程技术有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医学器械厂)。

1.2 药物与试剂

白胡椒(海南省国营东昌农场)，乙醇(体积分数95%，食品级)，甲醇(色谱纯)，重蒸水。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

流动相:甲醇－水(70∶30);检测波长为343 nm［10］;25℃;进样量 20 μL，流速 l mL/min。胡椒碱在此条件下保留时间约为5.8 min。

2.2 标准曲线的绘制

精密称取胡椒碱对照品25.0 mg，置于50 mL容量瓶中，用乙醇溶解至刻度，精密移取此溶液3，4，5，6，7，8 mL 分别置于 25 mL 容量瓶中，用乙醇稀释至刻度，定容。按2.1项下色谱条件进样，以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程:y=149.30x－388.96，R2=0.9989，结果表明胡椒碱浓度在 60.48～161.28 μg/mL范围内，胡椒碱峰面积与进样量有良好的线性关系。

图1 胡椒碱标准曲线

2.3 胡椒碱的纯度测定

取各条件制得的胡椒碱结晶2.5 mg置25 mL棕色容量瓶中，加95%乙醇定容成100 μg/mL的溶液。按2.1项下色谱条件精密吸取20 μL溶液进样，所得峰面积带入对照品标准曲线方程内计算得出其实际浓度，然后计算其纯度。

2.4 乙醇量及提取时间对提取率的影响

设计乙醇的用量为三个水平:10∶1，8∶1;8∶1，6∶1;6∶1，4∶1。回流时间也为三个水平即 1.5 h，1 h，0.5 h.

分别取100 g已粉碎白胡椒，置于烧瓶中，按下图实验设计所需加入95%乙醇并加热回流提取规定时间，所得结果如下:

表1 实验结果对照

从图中可以看出，95%乙醇与胡椒的体积质量比分别为 8∶1，6∶1时，提取 1 h 和 1.5 h 明显优于0.5 h，提取1.5 h 和1 h 相差仅 4.3%，为了节约成本，故提取1 h更为合适;当提取时间为1 h时，乙醇与胡椒的体积质量比为 10∶1，8∶1和 8∶1，6∶1的明显优于6∶1，4∶1，但用10∶1，8∶1的量仅比用8∶1，6∶1时多出 3.4%，乙醇与胡椒的体积质量比为 8∶1，6∶1时更好。所以以乙醇与胡椒的体积质量比为8∶1，6∶1，分别提取1 h最好，既能尽可能多得提取出胡椒碱，又节约生产成本。

2.5 重结晶时温度的影响

表2 40℃，60℃，80℃下重结晶对胡椒碱结晶量的影响

取100 g胡椒，粉碎，分别加入1000 mL，800 mL乙醇提取两次，每次1 h，制得的胡椒碱粗品在40℃，60℃，80℃下溶解，重结晶2次。从表2中可以看出，40℃下所得结晶很少，80℃时最多。但是考虑到80℃已经超过乙醇的沸点，在此温度下溶解胡椒碱粗品时，乙醇会很快蒸发，无法准确把握需要乙醇量;且结晶时发现，母液干涸，成果冻状，不好分离出结晶，所得结晶纯度较低。所以应改考虑60℃和70℃情况下胡椒碱的结晶情况。

表3是胡椒碱在60℃，70℃下重结晶的比较。其中编号1～5提取胡椒碱时所用95%乙醇与胡椒碱的体积质量比为10∶1，8∶1;除编号4以外均为重结晶2次。经过HPLC测定编号4的样品后发现，在60℃下重结晶一次纯度便可达到90%以上。故在编号6～11的样品均只结晶了1次，测定后发现纯度均能超过90%。

由于在中期实验中发现，提取液中的胡椒碱用10∶1，8∶1的量乙醇仅比用 8∶1，6∶1的量时多出3.4%，用乙醇与胡椒的体积质量比为 8∶1，6∶1更好，所以编号6～11的样品选用体积质量比为8∶1，6∶1的比例。

表3 60℃和70℃下胡椒碱重结晶的比较

从表3中比较60℃和70℃重结晶后胡椒碱得率后可以发现，60℃和70℃相差不大。而60℃下的结晶纯度比70℃下的稍高。70℃下胡椒碱的溶解率较高，相对60℃下结晶时加入的乙醇量难控制些，结晶颜色也比60℃下的深。故最终选定60℃为最佳重结晶温度。

3 结论

本论文以白胡椒为实验材料，使用体积分数为95%的乙醇进行提取胡椒碱，对乙醇法提取胡椒碱的工艺进行了研究。实验采用高效液相色谱法对提取物的纯度和提取率进行测定，以寻找最佳工艺流程的方法。通过实验可以得出:用95%的乙醇提取胡椒碱，便于回收再利用，乙醇回收达80%以上。用乙醇与胡椒的体积质量比为8∶1，6∶1回流提取1 h后，在60℃下重结晶胡椒碱粗品，所能得到的纯度90%以上。本实验所选用的工艺，产品经精制后得到纯度高，工艺简单，适于大规模生产的特点，对大规模生产有借鉴意义。

［1］Pradeep C R，Kuttan G.Piperine is a potent inhibitor of nuclear factor－kappaB(NF－ kappaB)，c－ Fos，CREB，ATF－2 and proinflammatory cytokine gene expression in B16F－10 melanomacells［J］.Int Immunopharmacd，2004，4(14):1795－1803.

［2］Mittal R，Gupta R L.In vitro antioxidant activity of piperine［J］.Methods Find Exp Clin Pharnmcol，2000，22(5):271.

［3］Szolcsanyi J，Bartho L.Capsaicin-sensitive afferents and their role in gastroprotection:an update［J］.J Physiol Paris，2001，95(1－6):181－188.

［4］Lee S A，Hong S S，Han X H，et a1.Piperine from the friuits of piper longum with inhibitory effect on monoamine oxidase and antidepresent－ like activity［J］.Chen Pharm Bull(tokyo)，2005，53(7):832－835.

［5］Dogra R K，Khanna S，Shanker R.Immunctoxicological effects of piperine in mice［J］.Toxicology，2004，196(3):229－ 236.

［6］刘文，孙宇章.胡椒中胡椒碱的提取工艺研究［J］.中国中药杂志，2003，28(5):456－457.

［7］侯文洁，张卫刚，薛文娇.胡椒中胡椒碱的提取工艺研究［J］.中国调味品，2008，(5):55－58.

［8］周叶燕，樊亚鸣，高绍中，陈永亨.动态一微波法提取黑胡椒油树脂的中试研究［J］.食品科技，2009，34(11):175－179.

［9］刘红，曾凡达.乙醇法提取黑胡椒油树脂的研究［J］.学术论坛，2011，2，69－71.

［10］张华云，宿松光，林玉海.高效液相色谱法测定胡矾口腔膜中胡椒碱的含量EJ3［J］.中国医院药学杂志，2006，26(5):630－631.