不同采收期东北铁线莲药材中灵仙新苷的含量变化研究
2013-12-09董彩霞刘丽芳
史 记，管 越，周 洋，董彩霞，姚 岚，刘丽芳
东北铁线莲(Clematis manshurica Rupr.)为毛茛科铁线莲属多年生草本植物，其干燥根和根茎是2010版中国药典收载药材威灵仙的3个主要来源之一(另2个来源为威灵仙 Clematis chinensis Osbeck.、棉团铁线莲 C.hexapetala Pall.的根和根茎)。别名东北威灵仙、辣蓼铁线莲、山辣椒秧子，一般用根部入药，地上茎也可以食用。生于山野林边、田埂及路旁。分布于我国东北、山西、山东、河北、内蒙古东部;朝鲜、俄罗斯远东地区也有分布。它是习用传统中药，味辛咸、性温，具有祛风除湿、通络止痛的功效。主要用于治疗风湿痹痛、关节不利等证。现代研究表明东北铁线莲中含多种皂苷类成分［1－4］，已报道的药理实验结果揭示皂苷类成分是该药材发挥抗炎镇痛活性的主要有效成分［5－7］。灵仙新苷(Clematichinenoside AR，以下简称AR，分子量为1806，化学结构式见图1。)是威灵仙药材中提取的一种主要皂苷类成分，我们前期的药理研究结果表明，灵仙新苷对弗氏佐剂引起的大鼠免疫性炎症的继发病变具有显著的治疗作用［8］。目前已有的报道中，AR仅在毛茛科铁线莲属植物中发现，其含量高低对于威灵仙药材的质量评价具有十分重要的意义。
图1 灵仙新苷(AR)的化学结构式
为合理开发东北铁线莲，确定其质量的优劣和最佳采收期，我们采用HPLC法测定了不同时期采收药材中AR的含量，以研究其在东北铁线莲根中含量的动态变化规律，为该药材的质量控制和进一步开发利用提供科学的依据。
1 材料与仪器
1.1 材料
采自吉林省舒兰市亮甲山乡，经中国药科大学刘丽芳教授鉴定为东北铁线莲的根及根茎。药材从5月末采集到10月中旬，共计取样13次，所有样品去泥粉碎，过40目筛备用。
1.2 仪器
Agilent1200液相色谱仪(美国);Diamonsil C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，美国迪马公司)，AUY120型电子分析天平(日本Shimadzu公司)，KH－250DB超声清洗仪(昆山禾创超声仪器有限公司);RE52CS－1型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司，HH－4);灵仙新苷(clematichinenoside，AR)对照品(自制，纯度 ＞98%，HPLC法);纯净水(娃哈哈纯净水);乙腈(Merck公司，色谱纯);甲醇(分析纯，南京化学有限公司)。
2 实验方法
2.1 对照品溶液的制备
取AR对照品约10.0 mg，精密称定后用30%乙腈溶解并定容至10 mL，制成每毫升含1.026 mgAR的溶液。
2.2 样品溶液的制备
将东北铁线莲药材粉碎，过40目筛，取约0.5 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加入50%甲醇20 mL，加热回流提取2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液减压浓缩至干，冷却至室温，用30%乙腈溶液转移至10 mL容量瓶中，定容，混匀，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液。
2.3 样品溶液提取方法的考察
2.3.1 提取方法的优选设计
经考察50%甲醇提取优于水和乙醇提取，加热回流的方法优于超声和冷浸，为系统考察各种因素对提取结果的影响，采取正交实验，考察溶剂倍量、提取时间、提取次数3个因素，测定AR的含量，按四因素三水平进行L9(34)正交实验。各因素水平见表1，实验结果和方差见表2、表3。
表1 东北铁线莲甲醇提取正交实验因素水平表
表2 正交设计及结果
表3 提取方法考察方差分析表
由表2、表3可以看出影响东北铁线莲AR提取的主次因素为A＞B＞C，A和B两因素均有显著性差异，从均值K可以看出最佳提取方案为A2B3C2。即20 mL的50%甲醇，加热回流提取2次，每次1.5 h。2.3.2 验证实验
按正交实验确定的最佳提取条件，即100 mL的50%甲醇，加热回流提取2次，每次1.5 h，平行三组放大5倍的量进行验证，测定AR含量为2.1%和正交实验结果中的较优组2.12%含量相似，且RSD=1.53%，表明此正交实验得出的最优组合符合实际。此外，在其他条件不变的情况下追加提取时间为2 h的情况，得AR含量为2.01%，并未高于提取时间1.5 h每次，进一步验证了实验结果。
2.4 测定方法
色谱条件 色谱柱:Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm，5μm)柱;流动相:乙腈(A)－水溶液(B)，梯度洗脱程序(见表4);流速:1.0 mL/min;检测波长:203 nm;柱温:30℃;进样量:20μL。
表4 梯度洗脱程序
图2 AR对照品色谱图
图3 样品色谱图
2.5 标准曲线
吸取对照品溶液 1.25，2.5，5，7.5，10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加30%乙腈稀释至刻度，摇匀，分别配成 0.13，0.26，0.51，0.77，1.026 mg/mL 的系列对照品溶液;分别精密吸取上述不同浓度对照品溶液20μL注入色谱仪，按照上述色谱条件测定，以峰面积(A)为纵坐标，AR浓度(C)为横坐标，绘制标准曲线，计算得回归方程为 A=3 381.6C－50.752，r=0.9992，表明 AR 浓度在 0.13 ～ 1.026 mg/mL内与峰面积呈良好的线性关系。
2.6 精密度考察
精密吸取AR的对照品溶液20μL，按上述色谱条件进行测定，重复进样6次，测定峰面积。结果显示该方法的精密度良好(RSD=0.67%，n=6)。
2.7 重复性考察
取同一批东北铁线莲样品，平行称定6份，按照2.2操作，每份精密吸取20μL，同法测定，计算，结果显示6份样品中AR的平均含量为4.47%，RSD=0.77%(n=6)，表明该方法重复性较好。
2.8 稳定性考察
取同一供试品溶液分别在 0，0.5，5，7.5，10 h内同法测定，计算，结果表明RSD为0.81%，表明样品在10 h内稳定。
2.9 回收率考察
取已知含量的东北铁线莲药材粉末适量，精密称定6份，分别精密加入AR对照品适量，同法制备样品溶液，进样20μL，以外标法计算含量，结果显示，在本实验条件下，AR的平均回收率为102.9%，RSD=1.6%(n=6)，表明该法的准确度较好。
3 实验结果
3.1 不同采收期样品中AR的含量变化
取不同时期采收的样品，按上述方法制备样品溶液，同法进行测定，用外标一点法计算药材中AR的含量。测定结果见表5，图4。
表5 不同采收期样品中AR的含量
图4 不同采收期样品中AR含量
4 讨论
从表5和图4可知，AR含量变化为5月末较高，7月末较低然后逐渐递增，直至9月初达到顶点，然后缓慢下降。AR为三萜皂苷，是次生代谢产物，它在东北铁线莲根内的积累可能与日照、温度、水分、土壤状况等多种环境因素有关。有关报道表明［9］，适度遮荫有利于东北铁线莲生长发育，有利于三萜皂苷的积累，但光照太弱则会影响还原糖的生成，进而影响皂苷的生成。5月末和8月末到9月中旬的日照均处于适中的强度，利于AR的积累。吉林地区最热的是7月，降水集中在6至8月。适度干旱能刺激植物中次生代谢产物的积累，三萜皂苷的含量也会上升，和结果中的降水量不多的8月末到9月中旬AR含量高相符。适度的高温利于植物中三萜皂苷的合成，所以温度适宜的5月底、8月底到9月中旬AR含量均较高。此外，东北铁线莲的花期是6～8月，7月最盛，果期是7～9月，可推测AR可能在开花时含量较低，而结果时含量较高。
另外，我们在实验中还发现，AR主要存在于东北铁线莲根的皮部中(高达7.2%)，木部中未检测到AR。这个现象也为5月底、8月底到9月中旬药材中AR含量相对较高的实验结果提供了佐证，我们推测可能是由于在这2个时间段内，由于日照、温度、降水等环境因素的影响，有利于东北铁线莲根皮部的次生代谢产物的形成，故在此期间，药材中该成分的含量相对较高。
东北铁线莲最佳采收期可以参考AR含量较高的8月下旬到9月中旬(8.25～9.15)为宜，这对保证药材质量具有重要的意义。
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