鸡骨渣中蛋白质的酶解应用效果研究

李苗云，赵改名,*，许 雄，王玉芬，谢 华，柳艳霞，田 玮

(1.河南农业大学食品科学技术学院，河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450002；2.双汇集团技术中心，河南 漯河 462000)

我国是世界鸡肉生产、消费和贸易大国，2009年鸡肉产量约1210万t，鸡骨约占胴体质量的10%～30%，年产鲜鸡骨约2000万t，但用于深加工的鸡骨不足总量的2%[1]。鸡骨通过骨肉分离机获取其上面残留的鲜肉，而排出的废渣俗称骨渣，价格更是低廉，而鸡骨渣中含有丰富的蛋白质(13%～15%)和生物活性物质，有极大的潜在应用价值[2]。

近年来，酶解技术在食品副产物综合利用方面得到了广泛研究与应用，具有反应温度低、时间短、无环境污染以及营养价值高等优点[3-5]。骨的利用主要集中在酶解提取营养物质[6-8]，软骨中的硫酸软骨素提取[9-10]等，主要是骨肉原料高温高压蒸煮后酶解，投入的成本较高。而鸡骨渣的颗粒感给生产带来的不便以及鸡骨本身带有的腥味[11]，使很多企业难以消化大量成本低廉的鸡骨渣。将骨蛋白直接进行酶解处理后，营养价值较高，可以制备功能性肉类提取物或开发高附加值的调味料，提高其利用价值[12]，而目前鸡骨渣酶解后的应用研究很少，限制了骨渣的利用。因此，如何有效的加强新鲜鸡骨渣的合理加工和综合利用是亟待解决的重要问题之一。

本实验通过确定不同蛋白酶水解鸡骨渣的最适温度，研究其水解产物的氨基酸组成和以酶解浓缩液为原料生产鸡肉香精的效果，确定适用于深度加工鸡骨渣的蛋白酶类，提高鸡骨渣附加值，对于企业的可持续发展具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鸡骨渣、鸡骨油、水解植物蛋白液、酵母抽提物、谷氨酸、半胱氨酸、葡萄糖、木糖、VB1、呋喃酮、甲硫氨酸、半胱氨酸盐酸盐-水合物、味精、I+G 漯河双汇生物工程公司。

1.2 试剂与仪器

复合蛋白酶(1.5AU/g)、中性蛋白酶(1.5AU/g)、碱性蛋白酶(2.5AU/g)(1AU为1min水解变性血红蛋白产生1mmol酪氨酸的酶量) 丹麦诺维信公司；木瓜蛋白酶(6.0×105U/g) 比利时PSM有限公司；其余试剂均为国产分析纯试剂。

3205型食品加工机(调理机) 匈牙利博朗电器公司；YXQGOI型蒸汽消毒器 山东新华医疗器械厂；1100型高效液相色谱仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鸡骨渣的酶解与小试处理

在查阅文献[13-14]和前期研究[15]基础上选用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶的最佳酶解条件进行鸡骨渣的酶解效果研究。木瓜蛋白酶：温度65℃、加酶量0.10%、反应时间1.8h、自然pH值和料液比1：1(m/V)；碱性蛋白酶：温度60℃、加酶量0.12%、反应时间2.5h、自然pH值和料液比1：1；中性蛋白酶：温度58℃、加酶量0.20%、反应时间2.2h、自然pH值和料液比1：1；复合蛋白酶：温度60℃、加酶量0.20%、反应时间2h、自然pH值和料液比1：1。

取混匀后新鲜鸡骨样品50g(精确至0.01g)，放入250mL三角瓶中，加入一定量的水，分别加入上述4种蛋白酶，在其最适宜的酶解条件下，置于水浴恒温振荡器中进行水解。水解完毕，于90℃灭酶15min，之后将样品水洗冲渣过滤，一并转入250mL容量瓶中，定容。测定残渣量、水解度和总氮回收率以验证酶解效果。同时进行40kg级中试，测定残渣量与小试进行对比。

1.3.2 40kg级酶解鸡骨渣的中试处理

在某公司原料库，同批同质随机取新鲜鸡骨，充分混匀后，加入一定量的水，分别选用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和复合蛋白酶在各自最佳的酶解温度和时间进行酶解。酶解后于90℃、15min灭酶，之后将样品水洗冲渣过滤，将剩余的残渣于25℃，自然晾干2h。分别测定鸡骨渣酶解后的残渣量、鸡骨渣酶解液中氨基酸含量以及制备鸡肉香精。

1.3.3 鸡骨渣酶解液氨基酸的测定

取中试处理的酶解液，用高效液相色谱测定游离氨基酸含量。准确称取样品5g(精确到0.0001g)，加去离子水15mL，加10%的磺基水杨酸20mL，搅匀放置24h，中速滤纸过滤后，用4mol/L的NaOH调整pH值至6.0，定容至50mL的容量瓶，取1mL经过孔径0.45μm滤膜除去大分子。移取10μL样品于小试管底部，将小试管置于真空瓶中，待试管内液体抽干，向小试管内加20μL衍生缓冲溶液，涡旋10s后，再加入20μL衍生试剂溶液，涡旋振荡10s，60℃避光反应60min后冷却，再加入160μL平衡缓冲液，涡旋振荡20s后转移到样品瓶。待测。

色谱分析条件：色谱柱：Elite-AAK氨基酸分析专用柱；洗脱速率1mL/min；进样体积l0μL；紫外检测器检测波长360nm；柱温23℃；洗脱时间48min；洗脱液A为乙腈、水体积比1：1；洗脱液B为1份流动相B溶液+9份经过孔径0.45μm滤膜过滤处理的高纯水。梯度洗脱变化如表1所示。

表 1 梯度洗脱变化Table 1 Changes of gradient elution

1.3.4 热反应鸡肉香精的制备

表 2 鸡肉香精反应配方Table 2 The reaction ingredients of chicken flavors

选择不同蛋白酶中试处理的酶解液，经蒸发浓缩后制得酶解浓缩液，以酶解浓缩液(HAP)为基料(可溶性固形物含量为40°Brix)，按照表2的配方取样，再加入味精、I+G和适量的水，于自然pH值条件下充分摇晃使其混合均匀后置于高压蒸汽消毒器中，115℃反应2h，然后在流动水中快速冷却，待冷至室温后制得鸡肉香精，盛装于细口瓶中密闭保存1d后进行感官评定。

1.3.5 残渣量的测定

残渣量指酶解后剩余残渣的质量占酶解鸡骨渣样品质量的百分比，该指标在一定程度上反映了骨肉分离的效果。酶解后，将剩余的残渣于25℃，自然晾干2h除去水分后称质量，即为残渣的质量。

1.3.6 水解度的测定

根据Alder-Nissen[16]的计算方法测定水解度(DH)。

1.3.7 总氮回收率的测定

取经充分混匀的酶解液5mL，于水浴挥干后，采用按ISO 937—1978(E)《肉和肉制品的氮含量测定(参考方法)方法》进行。

1.3.8 热反应鸡肉香精产物的感官评定方法

将闻香纸浸入产物1～2cm，由7名评香员闻香，同时按甜香、肉香、脂香、焦糊味、腥味、硫臭味香气的强度进行打分[17]，极弱1分，弱2分，适中4分，较强5分，很强7分。指标的权重分别为1、1.5、1、－0.25、－0.25、－0.5。

1.4 数据处理

采用SPSS 15.0软件处理。

2 结果与分析

2.1 鸡骨渣的酶解效果

应用4种蛋白酶的最佳酶解条件进行小试和40kg中试的酶解效果见表3。

表 3 不同蛋白酶的酶解效果Table 3 Hydrolysis efficiency of different proteases

4种蛋白酶在各自最佳酶解条件下的水解度以木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶较高，分别为14.68%和14.24%，木瓜蛋白酶总氮回收率最高，达71.68%，小试时的残渣量以木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶较低，分别为24.60%和28.40%；小试和中试后的残渣量均以木瓜蛋白酶最低，分别为24.60%和26.37%，且4种酶中试后的效果与小试基本一致。木瓜蛋白酶酶解后产品的脱肉效果最好，骨肉分离很干净，残渣量最低；而中性蛋白酶由于酶解后的鸡骨渣上还有较多可见的碎肉，残渣量最高，不适合单独用于酶解脱肉处理；复合蛋白酶经中试实验，产品残渣量在30.36%，骨肉分离较干净，但与木瓜蛋白酶相比，效果略差。

2.2 鸡骨渣酶解液中氨基酸测定结果

表 4 不同酶解液的主要游离氨基酸含量Table 4 FAA contents in different HAPs mg/g

从表4鸡骨渣不同蛋白酶酶解液中氨基酸的分析结果可以看出，水解液中的游离氨基酸含量较为丰富，人体所必需的8种氨基酸中，除色氨酸未检出外，其他7种必需氨基酸，即苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸的含量均较高。

在4种酶解液中，氨基酸总量差异显著(P＜0.05)，必需氨基酸占氨基酸总量的比例(EAA/TAA)较高，除碱性蛋白酶酶解液较低(P＜0.05)外，其他3种蛋白酶酶解液的EAA/TAA均在45%左右。木瓜蛋白酶酶解液中的EAA和TAA含量最高，分别为6.505mg/g和14.965mg/g。各种酶解液中普遍含量较高的氨基酸有天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸，共占氨基酸总量的55%左右。木瓜蛋白酶酶解液中谷氨酸和丙氨酸含量最高，分别为1.951mg/g和1.601mg/g。中性蛋白酶酶解液缬氨酸、苯丙氨酸含量最低且必需氨基酸含量显著低于其他3种酶解液(P＜0.05)；碱性蛋白酶酶解液中赖氨酸含量最低；中性蛋白酶酶解液中氨基酸总量最低。

2.3 热反应鸡肉香精感官评定结果

取经浓缩后的4种酶解液，按表2的配方于115℃反应2h，感官评价结果见表5，直观图见图1。

表 5 不同酶解液制备鸡肉香精的感官评价结果Table 5 Evaluation of chicken flavors prepared with different HAPs

图 1 不同酶解液制备鸡肉香精的风味图Fig.1 Flavor plot of chicken fl avors prepared with different HAPs

由表5和图1可知，不同蛋白酶酶解液制备的鸡肉香精的风味有显著差异(P＜0.05)。中性蛋白酶酶解液制备的香味料，肉香一般，较清淡，但是甜香明显，且不良气味较少，香气整体柔和，圆润。木瓜蛋白酶酶解液制备的香精，整体肉香突出，有良好的鸡脂风味，其总体上最易让人接受。碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解液制备的香味料的焦糊味与硫臭味较重，均与其他三者有明显差异(P＜0.05)。

3 讨 论

鸡骨渣是鸡骨架经过骨肉分离机后的副产物，低价低质，经4种蛋白酶酶解后，酶解液中氨基酸的含量丰富，为酶解液的应用提供了很好的条件[16]。碱性蛋白酶水解液中苦味最强的氨基酸较多，如精氨酸含量显著高于其他3种酶解液(P＜0.05)，且缬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸及异亮氨酸的含量相当丰富。中性蛋白酶酶解液中游离氨基酸的含量不高，但与糖反应能生产甜味的氨基酸占总游离氨基酸的量却比较高[18]，这可能是中性蛋白酶酶解液制备的香精甜味较突出的原因。木瓜蛋白酶酶解液中谷氨酸和天冬氨酸等具有鲜味的氨基酸以及甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等具有甜味的氨基酸含量丰富，这与前人的研究[8,12]结果相似，为其应用奠定了基础。在本研究中，以木瓜蛋白酶酶解液制备的香精，整体肉香突出，有良好的鸡脂风味，酶解效果最好，这与前人研究[13,19-20]木瓜蛋白酶水解鸡肉蛋白质的效果相似，与酶解液中的营养物质含量丰富有关。木瓜蛋白酶酶解鸡骨渣后的残渣量低，效果好，与其适应性强有关[13-14]。就4种蛋白酶价格相比，木瓜蛋白酶较低。因此，木瓜蛋白酶适合酶解鸡骨渣，对鸡骨渣的处理方式简单、方便，对设备的投入少，价格较低，为鸡骨渣的综合利用提供了新的突破口。

4 结 论

木瓜蛋白酶在最适酶解温度65℃、加酶量0.1%、反应时间1.8h、自然pH值和料液比1：1的条件下，酶解鸡骨渣后的残渣量最低，以其酶解液制备的香精，整体肉香突出，有良好的鸡脂风味，适合用于深度开发鸡骨渣。

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