薄层及凝胶色谱法测定树莓籽原花青素的平均聚合度

张佰清，闫冬雪

( 沈阳农业大学食品学院农产品加工与贮藏，辽宁沈阳110866)

随着树莓产业的发展，树莓籽作为树莓产品的副产物具有很高的利用价值，其中原花青素(PC)含量高达6.81～17.6mg/g。原花青素是可以在植物中提取出来的聚多酚类混合物，属于类黄酮类物质，由数量不同的儿茶素和表儿茶素聚合而成［1-7］。据报道，低聚原花色素(OPCs)具有很强的清除自由基和抗氧化能力，还有降血脂、抗癌等多种生物活性，在北美OPCs 已经被广泛应用于食品和化妆品行业［8］。除了原花青素含量是衡量原花青素质量的一个指标之外，聚合度也是一个重要标准之一。由于高聚体的聚合度是难以测定的，因此我们经常测定原花青素的平均聚合度。到现在为止，有文献报道用高效液相和高效液相色谱-质谱联用来测定不同聚合度的原花青素，但是这些分析手段不仅仪器昂贵，也受到对照品的限制，不适合测定所有聚合度的原花青素［9-11］。本文通过薄层色谱法将原花青素中聚合度不同的组分分离运用高效液相色谱法对其成分进行简单分析，并通过凝胶色谱法得到其平均聚合度，为进一步研究树莓籽原花青素的结构奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

树莓籽 辽宁今日农业有限公司，品种为秋红;原花青素标准品，纯度≥98%，葡萄籽提物 天津尖峰天然产物研究开发公司;硅胶GF254国药集团化学试剂有限公司;SephadexLH-20 上海亚东核级树脂有限公司;乙腈、甲醇 为色谱纯;其他试剂 均为分析纯;实验用水 去离子水。

RE52-AA 真空旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;UV-2000 紫外-可见分光光度计 Unico 上海仪器有限公司;AL204 型万分之一天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;LD-500 摇摆式药材粉碎机 长沙常宏药机;CR21G 高速冷冻离心机 Hitachi High-Technologies Corporation;DHL-A 电脑恒流泵、HD-3 紫外检测仪 上海沪西分析仪器厂;真空干燥箱 天津实验仪器厂;Lab Workstation 2006 型高效液相色谱仪 北京莱伯泰科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 提取方法 树莓籽用粉碎机粉碎后过筛，加入石油醚脱脂后抽滤，将树莓籽真空干燥后加入乙醇，超声波辅助提取树莓籽原花青素，离心得到粗提液［1］。

1.2.2 含量测定方法 采用香草醛-盐酸法测定原花青素含量，1mL 待测液添加入6mL 4%香草醛甲醇溶液和3mL 浓盐酸，在避光(20℃)的条件下反应15h 测定吸光度，计算原花青素含量［12］。

1.2.3 分离提纯方法 树莓籽原花青素粗提液经真空浓缩后用HPD100C 大孔树脂进行初步的分离提纯，洗脱液真空浓缩达到一定的浓度后通过薄层色谱法进一步的分离，通过Rf 值(薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值)判断层析效果［13-14］。

展开溶剂的选择:展开体系1:v(甲苯)∶v(丙酮)∶v(甲酸)=3∶6∶1;展开体系2:v(甲苯)∶v(丙酮)∶v(乙酸)=3∶4∶1;展开体系3:v(甲苯)∶v(氯仿)∶v(丙酮)=4∶2.5∶3.5;展开体系4:v(乙酸乙酯)∶v(丙酮)∶v(甲酸)∶v(水)=5∶3∶3∶1.

点样量的选择:配制4mg/mL 的原花青素溶液，选择1、5、10、15、20、25μL 使用毛细管点样，确定点样量。

1.2.4 分析方法 将通过薄层色谱分离开的色带刮下带有样品的硅胶，用甲醇洗脱，离心得上清液，真空干燥后分别将分离开的三条谱带配制成甲醇溶液，用HPLC 进行分析［15］。

液相色谱条件流动相:A 为2%冰醋酸;B 为乙腈∶水∶冰醋酸(80∶19.6∶0.4);检测波长:280nm;流速:1.0 mL/min;色谱柱:反相C18柱;进样量:10μL。

1.2.5 平均聚合度测定方法 通过凝胶色谱法［4］进行测定，用不同分子量的聚苯乙烯标准品以分子量为横坐标，保留时间为纵坐标绘制标准曲线。将分离产物溶解后上样于SPehadexLH-20 柱中，用8mol/L尿素-60%丙酮(4∶6)溶液以0.5mL/min 的流速进行洗脱，每隔5min 收集一管。按照标准方程得到相对分子质量，计算平均聚合度。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱法分离树莓籽原花青素

2.1.1 展开剂的选择 由表1 可以看出展开体系1、2 可以使谱带有效分离，而展开体系3 无分离，说明溶剂的极性过小。展开体系4 谱带无有效分离而斑点均聚集在层析板上缘，说明该展开体系的极性过大。展开体系1 虽然可以将谱带分开，但是Rf 值比较接近，因此选择分离效果较好的展开体系2 作为最佳展开剂。

表1 各展开体系的Rf 值Table 1 Rf of different expansion system

2.1.2 点样量的选择 由表2 得出，当点样量大于20μL 时谱带Ⅰ、Ⅱ无法有效分离，说明已经超载。在点样量为15μL 时谱带距离较近，但是仍然可以有效分离，因此选择15μL 为最佳点样量。

2.2 HPLC 分析分离产物

图1～图3 为经过HPLC 分离得到的图谱。

图1 原花青素标准品HPLC 色谱图Fig.1 HPLC of proanthocyanidin standards

图2 薄层谱带Ⅰ的HPLC 图谱Fig.2 HPLC of the TLC colour zone Ⅰ

图3 薄层谱带Ⅱ的HPLC 图谱Fig.3 HPLC of the TLC colour zone Ⅱ

以上实验得到的分析图谱与标准品HPLC 图谱比较，由图1 看出谱带Ⅰ是由没食子酸、儿茶素、表儿茶素(保留时间分别为8.065、20.021、33.892min)的单体物质构成。由图2 可以确定谱带Ⅱ中的一种B2(保留时间为31.573min)。谱带Ⅱ、Ⅲ的低聚体、高聚体组分非常复杂，还有待于进一步研究。

2.3 平均聚合度的测定

由于对原花青素高聚体的定性和定量是比较困难的，因此测定平均聚合度成为分析原花青素常用的方法。凝胶渗透色谱实际上是一种分子排阻色谱，研究发现可以采用此方法测定原花青素的聚合度。

由实验结果，根据聚苯乙烯标准品的洗脱曲线和分子排阻方程以分子量为横坐标，时间为纵坐标建立二者的相关方程，如图4 所示。

图4 薄层谱带Ⅲ的HPLC 图谱Fig.4 HPLC of the TLC colour zone Ⅲ

图5 为薄层分离得到的三条谱带的凝胶色谱图，由图中各谱带的保留时间，在标准曲线上计算出谱带Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均分子量分别为269，714 和1375。由HPLC 知谱带Ⅰ主要为儿茶素和表儿茶素为单体成分的物质，因此可推算出Ⅱ、Ⅲ的平均聚合度分别为2.65 和5.11。同时在凝胶色谱图中看到，三个谱带的洗脱图形有所不同。谱带Ⅰ图形比较尖锐，说明其分子构成简单。但谱带Ⅲ的曲线拖尾现象十分明显，这种拖尾现象可能是其产物构成较为复杂和多样，也可能是由于分级洗脱不够彻底造成的。

图5 聚苯乙烯分子量与保留时间的关系Fig.5 The coreralationship between molecular weight of polystyrene and retention time

3 结论

实验表明，展开剂为v(甲苯)∶v(丙酮)∶v(乙酸)=3∶4∶1，样品浓度4mg/mL，点样量15μL 时，薄层色谱对树莓籽原花青素分离效果最佳。HPLC 谱带分析表明树莓籽原花青素为多聚体混合物，通过凝胶色谱法测定三条谱带的平均聚合度，得出谱带Ⅰ单体物质为1，可以确定其组分包括没食子酸、儿茶素、表儿茶素，谱带Ⅱ中包括一种二聚体，平均聚合度为2.65，谱带Ⅲ的组分最为复杂，平均聚合度为5.11。由于各种异构体的结构、种类非常复杂，各组分出峰有待进一步探讨。

图6 各谱带的凝胶色谱图Fig.6 The chromatogram of Sephadex LH-20 gel permeation chromatography

［1］张佰清，张艳艳，李龙杰.微波提取树莓籽中原花青素工艺［J］.食品科学，2011，32(6) :25-28.

［2］孙芸，谷文英.硫酸-香草醛法测定葡萄籽原花青素含量［J］.食品与发酵工业，2003，29(9) :43-46.

［3］赵平，张志军，张月萍.葡萄籽提取物中原花青素的纯化及其检测［J］.食品科技，2009，34(11) :179-183.

［4］吴朝霞.葡萄籽原花青素分离提纯、组分鉴定及抗氧化性的研究［D］.沈阳:沈阳农业大学，2005.

［5］Kitamura Satoshi，Matsuda Fumio.Metabolic profiling and cytological analysis of proanthocyanidins in immature seeds of Arabidopsis thaliana flavonoid accumulation mutants［J］.Plant Journal，2010，62(4) :549-559.

［6］Travaglia Fabiano，Bordiga Matteo，Matsuda Fumio.Polymeric Proanthocyanidins in skins and seeds of 37 vitisvinifera L cultivars:A methodological comparative study［J］.Journal of Food Science，2011，76(5) :742-749.

［7］张佰清，李龙杰，张艳艳.二次柱层析制备高纯度树莓籽原花青素的工艺［J］.食品科学，2011，32(8) :163-166.

［8］ Ying Yang，Mingjien chien.Characterization of Grape procyanidins using HPLC-MS and MALDI-TOFMS［J］.J Agric Food Chem，2000，48:3990-3996.

［9］Wallace Taylor C，Ginsti Monnica.Evaluation of Parameters that Affect the 4 - Dimethylaminocinnamalde hyde Assay for Flavanols and proanthocyanidins［J］.Journal of Food Science，2010，75(7) :619-625.

［10］Haseeb Nawaz，John Shi，Gauri Smittal，et al.Extraction of polyphenols from grape seeds and concentration by ultrafiltration［J］.Separation and Purification Technology，2006，48:176-181.

［11］魏冠红，魏作军，苏宝根，等.测定原花青素平均聚合度的一种新方法［J］.中国食品学报，2006，6(6) :112-115.

［12］智勇刚，张芹，唐辉，等.天山花楸中原花青素的可见分光光度法测定［J］.食品科技，2009，30(6) :252-254.

［13］王庆玲，罗小玲，董娟，等.花生红衣中原花色素超声提取工艺的优化［J］.现代食品科技，2008，24(12) :1284-1287.

［14］吕丽爽，曹栋.薄层色谱法分离葡萄籽中的低聚原花青素［J］.无锡轻工大学学报，2001，20(1) :65-67.

［15］袁建平，吕艳，李丽美.HPLC 法测定金荞麦提取物中原花青素B2、表儿茶素［J］.中成药，2011，33(4) :708-710.