超声波辅助－盐析－水蒸气蒸馏法提取葛缕子精油的研究

李敏杰，陆兆新，赵海珍

( 南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095)

葛缕子(Carum carvi L)，别名藏茴香，为伞形科植物贡蒿的果实，其植物为多年生草本，分布西亚、欧洲，我国东北、华北、西北、四川、西藏等地。欧洲自古以来就把它作为芳香性驱风药和香料使用，《英国药典》1993 年版收载用于治疗腹胀和消化不良［1］，在我国葛缕子除作为调味料外，也是常用的藏药之一，葛缕子性温、味微辛，具有理气、止痛、解毒作用［2］。《中华本草》中藏茴香的功能主治为理气、止痛、解毒，主治“龙”病、眼病、食欲不振、胃痛、中毒症［3］。藏茴香含挥发油，油中含葛缕酮(carvone)、柠檬烯(limonene)及β-蒎烯等萜烯化合物，其中葛缕酮含量最高，为主要成分，其次是柠檬烯［4-6］。近年来，研究表明葛缕子精油还具有抗细菌、抗真菌、抗氧化、胃肠道保护、抗癌、抗黄曲霉毒素产生等作用［5，7-12］，因此葛缕子精油被广泛用作食品添加剂、调味剂和化妆品香精等。葛缕子精油的提取方法有水蒸气蒸馏法［13］、溶剂提取法［14］和超临界流体萃取技术［6，15］等。水蒸气蒸馏由于操作温度较高且时间较长会引起精油中热敏性化合物的热分解和易水解成分的水解;有机溶剂提取需要消耗大量的溶剂且提取率低，而超临界提取需要较高的压力。近年来，超声波提取技术在天然产物提取中显示了巨大的优势。超声波萃取或超声波辅助萃取的原理是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应和次级效应(如机械振动、如花、扩散、击碎、化学效应等)，提高萃取成分分子的运动速度和频率，增强溶剂穿透力，从而使萃取成分与溶剂充分混合，加大了萃取的效率，加快了植物有效成分的溶出［16］。目前此方法倍受广大研究者的关注，并且大量应用于开发植物精油的萃取，如萃取鼠尾草精油、芳香植物精油(月桂、迷迭香、百里香、牛至和晚香玉)、大蒜挥发油等的研究。此方法最大的优点就是萃取温度较低、时间短、得油率高、节约能源。王欣等［17］采用超声波辅助法提取丰年虫油，结果表明该方法的提取时间(40min)比传统的溶剂抽提法时间(6h)缩短了8 倍，且油脂品质也比较高。本实验以NaCl 溶液作为盐析试剂，采用超声辅助-盐析-水蒸气蒸馏法对葛缕子精油进行提取，对所提取精油的化学成分进行气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分离鉴定，并与盐析-水蒸气蒸馏法的提取效果和精油成分进行比较，为葛缕子的有效开发和合理利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛缕子样品(干样)，产地西藏，将其用粉碎机粉碎过40 目筛，装入事先准备好的玻璃密封瓶内，置于阴凉干燥处储存备用。

SB-500DTY 超声波扫频清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司;水蒸气提油蒸馏装置，上海禾汽玻璃仪器有限公司;HP6890/5973 气相色谱-质谱仪美国Agilent 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水蒸气蒸馏提取葛缕子精油 准确称取10g葛缕子粉末按1∶15 料液比加入一定体积的15%氯化钠溶液，浸泡60min 后加热进行回流提取。当流出的馏分中无油珠时，停止蒸馏。分出葛缕子精油利用无水硫酸钠脱水，称量，计算精油的得率。所提精油低温密封保存备用。

1.2.2 超声波辅助-盐析-水蒸气蒸馏提取葛缕子精油 准确称取10g 葛缕子粉，放入圆底烧瓶中，按照一定的料液比与氯化钠溶液混合并浸泡一定时间，将圆底烧瓶放入超声波仪中，先在一定的功率、频率和温度下处理一定的时间，使植物细胞壁破碎，然后按照1.2.1 方法继续加热进行回流提取，用无水硫酸钠干燥，称重，计算精油得率。

1.3 实验设计

1.3.1 料液比对葛缕子精油得率的影响 准确称取10g 葛缕子粉末，以10%氯化钠溶液浸泡30min，在超声波功率300W、频率40kHz 的条件下处理30min，考察料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，W/V)对葛缕子精油得率的影响，确定合适的料液比。

1.3.2 氯化钠浓度对葛缕子精油得率的影响 准确称取10g 葛缕子粉末，以1 ∶15 料液比混合，浸泡30min，超声波功率300W、频率40kHz 的条件下处理30min，考察氯化钠浓度(5%、10%、15%、20%、25%)对葛缕子精油得率的影响，确定合适的料液比。

1.3.3 浸泡时间对葛缕子精油得率的影响 准确称取10g 葛缕子粉末，与15%氯化钠以1∶15 的料液比混合，浸泡一定时间后，在超声波功率300W、频率40kHz 的条件下处理30min，考察浸泡时间(15、30、45、60、75min)对葛缕子精油得率的影响，确定合适的浸泡时间。

1.3.4 超声功率对葛缕子精油得率的影响 准确称取10g 葛缕子粉末，与15%氯化钠以1∶15 的料液比混合，浸泡60min，在不同超声功率(200、250、300、350、400W)和频率40kHz 的条件下处理30min，考察超声功率对葛缕子精油得率的影响，确定合适的超声功率。

1.3.5 超声时间对葛缕子精油得率的影响 准确称取10g 葛缕子粉末，与15%氯化钠以1∶15 的料液比混合，浸泡60min，在超声功率250W 和超声频率40kHz 的条件下处理 不 同时间(15、30、45、60、75min)，考察超声时间对葛缕子精油得率的影响，确定合适的超声时间。

1.3.6 超声频率对葛缕子精油得率的影响 准确称取10g 葛缕子粉末，与15%氯化钠以1∶15 的料液比混合，浸泡60min，在超声功率250W 和不同超声频率下(25、28、40、59kHz)处理30min，考察超声频率对葛缕子精油得率的影响，确定合适的超声频率。

1.4 GC-MS 分析

葛缕子精油成分用HP 6890(II)GC-MS 进行分析鉴定，配有HP 5973 质谱仪(Agilent Technologies，Palo Alto，California，USA)，电子能量70eV。色谱柱为HP-5MS 毛细管柱(30m × 0.25mm，0.25μm film thickness);程序升温:起始温度50℃，以5℃/min 升至60℃，保持5min;以4℃/min 升至220℃，保持15min;载气(He)流速1.0mL/min;进样口温度250℃，进样量1μL，分流比:50∶1。电子轰击(EI)离子源;传输线温度250℃;离子源温度 230℃;四级杆温度150℃;质子扫描范围m/z 50-550;溶剂延迟时间4min。

精油的组成通过与GC-MS 系统的NIST 质谱库比对进行鉴定;采用面积归一化法进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 料液比对葛缕子精油得率的影响

适当的料液比可以使原料浸泡充分，达到更好的质壁分离效果，从而提高精油得率。由图1 可知，随着料液比增大，葛缕子精油得率逐渐提高，当料液比为1∶15 时，超声波辅助-盐析-水蒸气蒸馏法提取的葛缕子精油得率最高(4.08%)。溶剂量增加，会降低溶剂中葛缕子精油浓度，增加葛缕子精油与溶剂接触界面处浓度差，从而提高传质速率［18］，在一定时间内精油得率提高，但当料液比过高时，精油得率不但不会增加，反而有所降低，原因可能是溶剂量过多时，增溶于溶剂中的总精油量变化不大，但损失于溶剂中的量增加，故最终的精油得率降低。因此，选择料液比1∶15 作为后续研究条件。

图1 料液比对葛缕子精油得率的影响Fig.1 Effect of material to solvent ratio on caraway essential oil extraction

2.2 氯化钠浓度对葛缕子精油得率的影响

张芳等［19］在提取橘皮精油时发现采用氯化钠溶液可以提高精油产量并改善其质量，这可能是由于氯化钠的盐析作用使得更多精油能够被水蒸汽携带出来。本文也研究了氯化钠溶液对葛缕子精油得率的影响(图2)。由图可知，葛缕子精油得率随氯化钠浓度的增大逐渐升高，15%时达到最大，随后精油得率开始逐渐降低。这可能是由于高浓度氯化钠溶液会导致溶液爆沸，蒸馏无法控制，使得精油中的易挥发成分损失增加。这与Rivera 等［4］的结果相一致。Rivera 等采用磁场直接传导加热蒸馏葛缕子精油，发现提取液中氯化钠浓度越高精油产率越低，定量检测发现，随氯化钠浓度升高，精油中柠檬烯含量降低，葛缕酮的含量升高;当氯化钠浓度为10%和12%时，磁场直接传导加热的蒸馏开始爆沸，失去控制。本研究中最佳氯化钠浓度是15%。

图2 氯化钠浓度对葛缕子精油得率的影响Fig.2 Effect of sodium chloride concentration on caraway essential oil extraction

2.3 浸泡时间对葛缕子精油得率的影响

植物精油存在于植物的腺毛、油室、油管、分泌细胞或树脂道等各种组织和器官中，采用溶剂浸泡后可以使组织的细胞壁和细胞膜膨胀，进而分裂，植物内的精油随之分解出来，因此浸泡时间在一定程度上可以影响精油得率。由图3 可知，浸泡时间对葛缕子精油得率有一定的影响，但影响不明显(p ＞0.05)。浸泡时间为60min 时葛缕子精油得率最高，因此后续实验中浸泡时间为60min。

图3 浸泡时间对葛缕子精油得率的影响Fig.3 Effect of soaking time on caraway essential oil extraction

2.4 超声功率对葛缕子精油得率的影响

由图4 可知，葛缕子精油得率随超声功率的增大先提高后又降低，功率偏大和偏小时所得精油得率都不高，功率为250W 时精油得率最高。其原因可能是:当超声波功率较低时，超声波产生的空化作用较小，随着超声波功率的增大，其产生的空化作用也逐渐增强，使得原料细胞更充分的破裂，加速精油有效成分的渗出，使得精油得率提高;但在相同超声时间下，超声功率过大时，其空化效应大幅度增强，精油与体系的乳化作用也增强，损失于水介质的精油量也增加。因此最适超声功率为250W。

图4 超声功率对葛缕子精油得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on caraway essential oil extraction

2.5 超声时间对葛缕子精油得率的影响

由图5 可知，随着超声时间的延长，葛缕子精油得率提高，30min 时达到最高，45min 时保持不变，之后随着超声时间的延长精油得率下降。其原因主要是:一方面，随着超声时间的增加，细胞的破碎程度增加，有利于精油进入溶剂中;但另一方面，由于精油是易挥发的氧化性物质，当时间过长时，超声的热效应过大，温度过高，导致精油得率下降。综合考虑多方面因素(操作时间、能耗及提取效率等)，最适超声作用时间为30min。

图5 超声时间对葛缕子精油得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on caraway essential oil extraction

2.6 超声频率对葛缕子精油得率的影响

由图6 可知，葛缕子精油得率随超声频率的变化产生明显的变化，随超声频率的增加精油得率逐渐下降，当频率增加到59kHz 时，精油得率显著下降。超声频率高时空化效应明显，有助于产物的渗出，但超声频率高时也有助于产物与提取体系乳化作用的发生，这样产物损失于提取介质中的量也增加，故而可能会导致产物最终产率的降低。因此，本实验中最适超声频率为25kHz。

2.7 超声辅助盐析-水蒸气蒸馏法最优结果及与盐析-水蒸气蒸馏法的比较

根据上面的单因素实验结果，获得超声辅助盐析-水蒸气蒸馏法提取葛缕子精油的最佳条件为料液比1∶15，氯化钠浓度为15%，浸泡时间60min，超声频率25kHz，超声功率250W，超声时间30min。在最佳条件下进行提取实验，葛缕子精油得率为5.42%±0.01%。将盐析-水蒸气蒸馏提取法与超声波辅助盐析-水蒸气蒸馏提取法进行比较，实验结果列于表1。由表1 可见，与盐析-水蒸气蒸馏提取法相比，超声波辅助提取法可在一定程度上缩短葛缕子精油的提取时间，同时葛缕子精油得率也比传统提取法提高了1.24%。这是由于一定频率的超声波产生的强烈空化效应和次级效应(如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等)可使细胞壁破裂，提高萃取成分分子的运动速度和频率，增强溶剂穿透力，从而使萃取成分与溶剂充分混合，加大了萃取的效率，同时，超声可促进溶剂与活性成分的双向转移，提高得率，缩短提取时间。由此可见，与传统水蒸气蒸馏提取法相比，超声波辅助水蒸气蒸馏法提取葛缕子精油不仅可以缩短提取时间，还可以提高精油产率。

表1 超声波辅助水蒸气蒸馏提取法与传统水蒸气蒸馏提取法的比较Table 1 Comparison between ultrasonic-assisted salting-out hydrodistillation extraction(UASHDE)and salting-out hydrodistillation extraction(SHDE)

2.8 葛缕子精油的挥发性成分

按照1.5 节的气相色谱-质谱条件对两种方法提取的葛缕子精油进行分析。根据葛缕子精油的总离子流图，用GC-MS 仪NIST98 谱库自动检索被分析组分的质谱，并对检索结果进行人工核对。成分的鉴定结果及各化合物的质量分数见表2(质量分数利用毛细管气相色谱面积归一化法计算)。

据表2 可知，分别鉴定出27(超声波处理)和15(直接蒸馏)种化合物，鉴定成分占各自提取成分总峰面积的比例分别为99.98%和99.92%。两种方法提取的葛缕子精油中主要成分有β-月桂烯、柠檬烯、二氢香芹酮、香芹醇、右旋香芹酮、紫苏醛等。其中右旋香芹酮质量分数最高，分别占总质量分数的76.29%和66.42%，然后是柠檬烯，分别占总质量分数的21.84%和31.08%。虽然最主要的成分都是右旋香芹酮和柠檬烯，这与阎卉等［20］、ISIDORA 等［5］的实验结果相一致，但在含量上却存在比较大的差异，这与Rivera 等［4］的报道相一致，因为提取方法对葛缕子精油的组成成分有较大的影响。姜子涛等［8］采用微波辅助水蒸气蒸馏法提取葛缕子精油，GC-MS分析结果表明，其主要成分是芹菜脑(12.3%)、右旋香芹酮(31.3%)和柠檬烯(48.4%)。另外，从表2 发现，超声处理后，一些微量的功效成分如β-水芹烯、1，3，8-对-薄荷三烯、香芹酚、香叶酸甲酯等都可被蒸馏获得，这可能与超声处理加速葛缕子精油成分的渗出从而加速蒸馏过程降低精油挥发损失有关，由此可见，超声辅助的盐析-水蒸气蒸馏法提取的葛缕子精油质量更高。

3 结论

本文在UASHDE 提取葛缕子精油的研究中，确定最适提取条件为:料液比1 ∶15，氯化钠浓度为15%，浸泡时间60min，超声频率25kHz，超声功率250W，超声时间30min。在最佳条件下进行提取实验，葛缕子精油得率为5.42% ±0.01%，比SHDE 提取结果提高了 1.24%，时间也从 90min 缩短到75min。

UASHDE 和SHDE 提取的葛缕子精油中主要成分有β-月桂烯、柠檬烯、二氢香芹酮、香芹醇、右旋香芹酮、紫苏醛等，其中右旋香芹酮和柠檬烯含量较高，分别为66.42%和76.29%，31.08%和21.84%，是葛缕子的主要有效成分。

表2 超声辅助水蒸气蒸馏法提取葛缕子精油的成分Table 2 Analysis results of caraway essential oils constituents obtained by UASHDE and SHDE

UASHDE 对葛缕子精油中热不稳定和易挥发性化合物有更好的提取效果。

上述研究结果表明，UASHDE 提取葛缕子精油不仅可以缩短提取时间，提高精油得率，还可以改善精油的质量。

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