没食子酸的体外抑菌作用研究

张雅丽，李建科 ，刘 柳

( 陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062)

没食子酸(Gallic acid)，为3，4，5-三羟基苯甲酸，分子式为C7H6O5，分子量为170.12，通常以一水合物的状态存在，是白色或微黄色针状晶体，是一种天然的多酚类化合物。它以游离酸形式或形成酯类化合物存在于五倍子、茶、没食子等植物中，是植物体中一类次生代谢产物，属于低毒物质，可用于医药、有机合成和食品、农业、矿产等领域［1］。食品是人类生存的基础物质，随着社会经济发展、生活水平的提高，人们越来越重视对食品污染菌的控制。国内外对没食子酸的生物活性研究涉及抗氧化、抗肿瘤、抗突变等［2-4］。有报道证实［5］没食子酸在体外对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌等具有很好的抑制作用，但从食品安全角度对其抑菌作用的研究报道少且不系统。本文以食品中常见食源性致病菌和腐败菌为供试菌，研究了没食子酸的体外抑菌活性，并通过扫描电镜观察了高敏感菌的形态结构的变化，为没食子酸抑菌机制的深入研究及应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，以上菌株均由陕西师范大学食品工程与营养科学学院功能食品与安全实验室提供;蛋白胨、酵母浸粉、琼脂均为国产生化试剂;氯化钠、氢氧化钠、没食子酸(一水)均为国产分析纯。

LDZX-30KBS 立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;SPX 智能型生化培养箱 宁波江南仪器厂;THZ-D 型台式恒温震荡器 太仓市实验设备厂;680 型酶标仪 美国伯乐公司;YJ-HS-1 单人水平型洁净工作台 苏净集团安泰公司;牛津杯 内径(6.0 ±0.1)mm，外径(7.8 ±0.1)mm;Quanta200 型环境扫描电子显微镜 FEI 公司。

1.2 实验方法

表1 没食子酸对各菌的最小抑菌浓度Table 1 The minimal inhibitory concentration of Gallic acid on different pathogens

1.2.1 LB 培养基［6］液体培养基:蛋白胨1g、酵母浸粉0.5g、氯化钠1g，蒸馏水100mL，调pH7.3;固体培养基中加2g 琼脂粉，其它同上;121℃高压灭菌20min。

1.2.2 活化菌种及制备菌悬液［7］将保存在试管斜面培养基上的菌种，通过划线法接种于LB 固体平板上，37℃培养24h，连续培养两代;取活化后的单菌落接种于5mL LB 液体培养基中，37℃、110r/min 培养16h，并以LB 液体培养基稀释菌液浓度为105CFU/mL作为供试菌菌悬液，备用。

1.2.3最小抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration，MIC)的测定［8］采用液体二倍稀释法，用LB 液体培养基将没食子酸制成终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL 的溶液;各取5mL 做为实验组，以不加没食子酸的LB 培养基为对照组，分 别 加 入 200μL 供 试菌 菌 悬 液，37℃、110r/min培养24h，以肉眼观察，没有变浑浊的最低浓度为没食子酸对该菌的最小抑菌浓度，每组重复3 次。

1.2.4 抑菌活性测定［9］采用牛津杯法。取各供试菌菌悬液200μL 于对应琼脂平板上，涂布均匀，每个平板上放2 个牛津杯，一个加入200μL 没食子酸溶液，另一个加LB 液体培养基作为对照组。将平板置于37℃恒温培养24h 后测抑菌圈直径，每组重复3次，取平均值。

1.2.5 对生长曲线的影响［10］用LB 液体培养基将没食子酸制成终浓度分别为1/2MIC、1 倍MIC 的溶液，各取5mL 做为实验组，以不加没食子酸的LB 培养基为对照组，分别加入200μL 供试菌菌悬液，在37℃、110r/min 条件下连续培养，每隔2h 用酶标仪测定OD630nm值，直到各菌生长达到稳定期，每组重复3 次，取平均值，制作OD630nm-t 生长曲线。

1.2.6 用扫描电镜观察对单增李斯特菌形态的影响［11］以加入1 倍MIC 浓度的没食子酸组为实验组，以不加没食子酸的为对照组。两组各取5mL，分别加200μL 单增李斯特菌菌悬液，37℃、110r/min 培养12h，随后按以下步骤分别处理实验组与对照组。在4000r/min 离心10min 收集菌体，在2.5%戊二醛溶液中4℃固定过夜，0.2mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液洗两次以洗去残存的戊二醛，分别用40%、70%、90%、100%(v/v)不同浓度的乙醇对菌体进行脱水处理各15min，然后将菌体涂在载玻片上，自然晾干，喷金，用扫描电镜进行观察。

2 结果与分析

2.1 抑菌效果的研究

由表1 可知，没食子酸对供试菌都有抑制效果。对单增李斯特菌的抑菌效果最好，MIC 为0.125mg/mL;对大肠杆菌次之，MIC 为0.25mg/mL;对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌的效果较弱，MIC 分别为2、4、4、4mg/mL。最小抑菌浓度可作为评价抑菌物质体外抑菌活性强弱的指标，MIC 值越小，说明该物质对此菌的抑制能力越强。许维国等［5］研究结果显示没食子酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌具有抑制作用，尤其对鼠伤寒沙门菌效果好。郑曙明等［1］研究了没食子酸对柱状黄杆菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌和迟缓爱德华菌4 种水产动物致病菌的体外抑菌作用，其中迟缓爱德华菌表现出较高的敏感性。本实验所用供试菌虽与上述研究中的不完全相同但都表明没食子酸具有很好的抑菌作用。

2.2 抑菌活性的研究

由表2 可知，没食子酸对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌6 种菌的抑菌圈直径分别为20.67 ±0.28、17.17 ±0.64、24.03 ±0.17、14.43 ±0.10、14.77 ±0.04、(15.07 ±0.03)mm。各菌均对没食子酸表现出不同的敏感性，其中单增李斯特菌最敏感、抑菌圈最大，大肠杆菌次之。因此在后面实验中，本文只用扫描电镜观察了没食子酸对高敏感菌单增李斯特菌形态的影响。并且没食子酸对枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌所产生的抑菌圈略有差异，3者中巨大芽孢杆菌抑菌圈最大。

表2 没食子酸对各菌的抑菌活性Table 2 The antibacterial activity of Gallic acid on different pathogens(mm)

2.3 对生长曲线的影响的研究

细菌悬液的光密度可反映出细菌浓度的大小，并进一步体现细菌的生长情况。如图1～图6 所示，对照组均呈现细菌典型的生长曲线，而加入1 倍MIC和1/2MIC 浓度的没食子酸后，细菌的生长曲线均有不同程度的改变。图1 中，1 倍MIC 浓度处理组中，大肠杆菌生长缓慢，与对照组相比，没食子酸主要抑制了其对数生长期的菌体分裂;而1/2MIC 浓度处理组中菌体虽进入对数生长期，但由于没食子酸的抑制作用，其OD630nm值小于对照组。图2～图6 中，1 倍MIC 浓度处理组中，各菌生长曲线都处于较低状态，但金黄色葡萄球菌在14h 后出现生长现象，可能是由于没食子酸被逐渐消耗，致使抑制效果持续时间短［10］，而蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌都能被很好的抑制;1/2MIC 浓度处理组中各菌体在没食子酸作用下OD630nm值均小于对照组。图3 中，经1 倍MIC 浓度处理的单增李斯特菌生长缓慢，不能进入对数生长期;而1/2MIC 浓度处理组中，菌体在10h 前生长缓慢，此后迅速生长，可能与没食子酸浓度低有关［12］。

图1 没食子酸对大肠杆菌生长的影响Fig.1 Effect of Gallic acid on Escherichia coli growth

图2 没食子酸对金黄色葡萄球菌生长的影响Fig.2 Effect of Gallic acid on Staphylococcus aureus growth curve

2.4 扫描电镜观察对单增李斯特菌形态影响的结果

由图7 可知，未经处理的对照组中A 单增李斯特菌形态完整、两端圆钝，呈现杆状，并且表面圆润、光滑，较分散，细胞间边界明显;而实验组B 中，菌体从中间处凹陷，大部分出现破损，具有明显的细胞原生质泄漏现象，致使细胞结成一团。可见没食子酸对菌体细胞具有损伤破坏作用，但是不能明确说明没食子酸与菌体细胞的结合位点，这有待进一步研究。

图3 没食子酸对单增李斯特菌生长的影响Fig.3 Effect of Gallic acid on Listeria monocytogenes growth curve

图4 没食子酸对枯草芽孢杆菌生长的影响Fig.4 Effect of Gallic acid on Bacillus subtillis growth curve

图5 没食子酸对蜡状芽孢杆菌生长的影响Fig.5 Effect of Gallic acid on Bacillus cereus growth curve

图6 没食子酸对巨大芽孢杆菌生长的影响Fig.6 Effect of Gallic acid on Bacillus megaterium growth curve

3 讨论

图7 没食子酸对单增李斯特形态的影响(A 对照组，B 实验组)Fig.7 Effect of Gallic acid on the cells of Listeria monocytogenes(A control group，B experimental group)

3.1 从抑菌作用上看，没食子酸在体外对各供试菌均有较好的抑制作用。有研究显示，茶多酚产生抑菌作用的分子结构基础主要是酚羟基［13］。没食子酸分子结构中含有3 个毗邻的酚羟基，因此酚羟基可能是没食子酸产生抑菌作用的活性基团。

3.2 扫描电镜观察没食子酸对单增李斯特菌形态影响的结果显示，菌体大部分出现破损，细胞原生质泄漏。耿飞等［14］研究乌梅提取液对单增李斯特菌的抑菌机理时发现，经1 倍MIC 浓度的乌梅提取液处理过的单增李斯特菌，细胞膜电位降低、胞内Ca2+浓度下降，证实乌梅提取液可作用于单增李斯特菌的细胞膜系统，使其细胞膜裂解、内容物泄漏。并且Sitohy 等［15］用透射电镜观察大豆球蛋白对单增李斯特菌的影响，发现被处理过的菌体变形、细胞膜破损。本实验结果与上述两者相似，说明没食子酸可能作用于单增李斯特菌的细胞膜，使其裂解，进而胞内物质外泄导致菌体死亡。

4 结论

没食子酸对6 种食品中常见食源性致病菌和腐败菌在体外具有很好的抑制作用，对单增李斯特菌抑制作用最好;不同浓度没食子酸对各菌生长曲线都有影响，其OD630nm值均小于对照组，并且浓度增大产生抑制作用增强。扫描电镜观察没食子酸对高敏感菌单增李斯特菌形态影响的结果显示，没食子酸可使菌体从中间处凹陷、大部分出现破损、细胞原生质泄漏。综上所述，没食子酸在体外具有很好的抑菌作用，期望为没食子酸的深入开发和利用及其抑菌机制的研究提供理论基础，以使其发挥更大的作用。

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