高糖对人肝星状细胞的激活作用及机制

吴剑锋，徐迪晖，赵海金

（1.解放军广州疗养院，广州 510515；2.南方医科大学南方医院消化科，广州 510515；3.南方医科大学南方医院呼吸科，广州 510515）

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是各种慢性肝病共有的病理变化，表现为胶原为主的细胞外基质（extracelluar matrix，ECM）在肝脏过度的沉积。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活是HF的中心关键环节，HSCs被激活后，其表型向肌成纤维细胞转化，合成大量α－SMA、胶原等基质成分而参与HF的发生发展［1］。糖尿病和HF关系密切，一方面慢性肝病可影响糖代谢；另一方面，近年来研究发现，糖尿病会促进慢性肝病HF的进展，是发生肝硬化的一个重要危险因素［2，3］。探讨高血糖在HF发病中的作用及其机制，有助于发现防治HF的新策略。本实验通过体外高糖（模拟糖尿病高血糖）处理人HSCs，观察研究高糖对人HSCs的活化作用及其机制，为临床防治糖尿病相关HF提供新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

D－葡萄糖、甘露醇购自Sigma Aldrich公司（USA），DMEM培养基以及特级胎牛血清（FBS）购自 Gibco BRL（USA），抗 TGF－β1抗体购自 Abcam（Cambridge，UK，ab64715），抗 MMP－2 抗体购自Sigma Aldrich（St.Louis，MO，SAB4501891），抗I型胶原抗体购自Abcam（ab34710），抗α－SMA抗体购自Santa Cruz Biotechnology（CA，sc－130619）。

1.2 细胞培养与处理方法

HSCs细胞由中山大学实验动物中心提供。在37℃、5%CO2的条件下，培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中。实验分组：正常对照组（normal glucose group，NG，5.5mmol／L葡萄糖）、高糖组（high glucose group，HG，30mmol／L葡萄糖）和渗透压对照组（osmolality control group，OC，5.5mmol／L葡萄糖＋19.5mmol／L甘露醇）。

1.3 Western blot测定蛋白的表达

HSCs细胞接种于60mm培养皿中，各实验组给予不同的处理因素后，用预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液，4℃静置30min，12 000r／min离心10min，取上清，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDSPAGE分离后，转移到PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭1.5h，随后加入抗 TGF－β1、MMP－2、I型胶原和α－SMA抗体（1∶1 000），4℃过夜，用TBST洗3次，10min／次。将PVDF膜用发光试剂ECL显色，暗室曝光到X线片上，凝胶成像系统扫描分析结果。

1.4 ELISA法测定TGF－β1的分泌水平

采用双抗体夹心ABC－ELISA法检测培养基中TGF－β1的水平。HSCs细胞接种于96孔培养板中，当80%融合时，分别给予不同的条件处理培养基，每组3个复孔。处理完成后，取100μL培养基加入预先用TGF－β1抗体包被的酶标板中，37℃孵育90min，然后吸出培养基，加入TGF－β1抗体继续孵育60min，经TBS漂洗3次，加入生物素标记的Ⅱ抗，反应30min，采用TMB法显色，经终止液终止反应后，用酶标仪（Muhiscan MK3，Thermo Labsystems）记录450nm波长处的吸光度。取3孔标准化处理后的A值进行统计分析。

1.5 统计学方法

实验数据用SPSS 13.0软件进行统计分析。所有结果以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one－way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖诱导HSCs细胞α－SMA表达上调

高糖处理HSCs细胞48h后，与NG组比较，α－SMA表达显著升高（见图1）；α－SMA是肌成纤维细胞的标志之一，该结果提示高糖可以诱导HSCs细胞活化。所有实验重复至少3次。

2.2 高糖引起HSCs细胞MMP－2和I型胶原表达上调

I型胶原是ECM的主要成分，而活化的HSCs细胞是合成I型胶原的主要细胞；HSCs细胞高糖暴露48h后，I型胶原表达明显增加（见图2）。MMP在 HF时表达升高，其中 MMP－2主要由HSCs细胞分泌表达；高糖刺激HSCs细胞48h，MMP－2表达显著升高（见图3）。

图1 高糖诱导上调HSCs细胞α－SMA的表达

图2 高糖增加HSCs细胞I型胶原的表达

2.3 高糖促进HSCs细胞TGF－β1的分泌

TGF－β1在器官纤维化中有关键性作用，激活的HSCs细胞可以分泌 TGF－β1。本研究发现，HSCs细胞在高糖刺激48h后，培养上清液中TGF－β1的表达明显增加（见图4）。

图3 高糖上调HSCs细胞MMP－2的表达

图4 高糖促进HSCs细胞TGF－β1的产生

3 讨论

慢性肝病和各种因素引起的肝损伤，最终修复创伤的结果是HF，其本质是ECM合成超过降解的病理过程，也是各种肝病和肝损伤导致肝硬化的共同通路［4］。研究证实，糖尿病高血糖有促进肝脏、肾脏和血管等器官纤维化的作用，而HF又影响机体糖代谢，二者互为因果，相互促进［5，6］。糖尿病性肝病作为糖尿病的慢性并发症之一，是指糖尿病引起肝脏组织结构和功能的病理变化（包括HF）。

研究证实，HSCs在HF发生发展中起关键作用，其激活和增殖是HF的中心环节，激活的HSCs表型转变为肌纤维母细胞，特异性表达α－SMA（是HSCs激活的标志，在静止期HSCs中无明显表达，也是HSCs激活程度和HF进展的一个重要指标），合成大量 ECM 促进 HF［7－9］。

本研究结果显示：高糖处理HSCs后可以诱发α－SMA、I型胶原和 MMP－2表达上调，提示高糖可以激活HSCs而促进 HF；此外，TGF－β1在 HF中有重要作用，可以诱导HSCs表型转变为分泌胶原的肌纤维母细胞，而HSCs也可以分泌TGF－β1，进而加重肝细胞损伤［10］；高糖刺激可以诱导HSCs分泌TGF－β1增加；高糖激活HSCs可能是通过TGF－β1信号通路。

综上所述，高糖可以激活人HSCs，进而促进HF的发生，其机制可能是通过TGF－β1通路。进一步深入研究高血糖和HF相互影响的内在机制，有助于发现防治糖尿病性HF的新策略，为糖尿病性肝损伤机制提供新的实验依据。

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