内质网应激相关的凋亡在糖尿病大鼠肾脏组织中的作用

陈玉凤，郭献山，耿秀琴，张会娟

(1新乡市中心医院，河南新乡453003;2郑州大学第一附属医院)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)的慢性并发症之一，是引起终末期肾功能衰竭的病因之一，严重影响着糖尿病患者生活质量［1］。已有报道，糖尿病模型肾组织中细胞凋亡数较非糖尿病肾脏明显增多，并伴有凋亡相关基因的改变［2］。内质网应激(ERS)是新发现的一种独立于以往经典的细胞膜受体或线粒体途径的第 3条凋亡信号途径［3］，以GRP78、Caspase12等作为ERS及相关细胞凋亡的标志性蛋白。2010年4～11月，本研究通过应用链脲佐菌素(STZ)诱导大鼠建立糖尿病模型［4］，观察在不同病程阶段，肾脏组织中的GRP78、Caspase12表达变化情况，探讨ERS在DN中的作用及意义，为DN的发病机制及治疗研究提供可能依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 血糖由德国艾柯夫公司Biosen血糖测量仪检测，24 h尿蛋白排泄量(采用考马斯亮蓝法，考马斯亮蓝G250，上海超研生物科技有限公司)、血肌酐在郑州大学第一附属医院化验室检测。STZ(规格100 mg/支)，由美国Sigma公司提供，兔抗鼠GRP78多克隆抗体(编号为bs-1219P)、兔抗鼠Caspase12多克隆抗体(编号为bs-1105R)购自北京博奥森生物有限公司。SP试剂盒、DAB显色剂购自北京中山生物技术公司，TRIzol reagent、RT-PCR试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，RT-PCR引物合成于北京赛百盛生物技术有限公司。

1.2 模型的建立及分组 32只清洁级健康雄性SD大鼠，8周龄，体质量180～220 g，由河南省实验动物中心提供。适应性喂养14 d，禁食水12 h，随机抽取 22 只，用溶于 0.1 mol/L、pH 4.0 柠檬酸/柠檬酸钠溶液稀释成1%的STZ溶液，按60 mg/kg一次性腹腔注射建立DM模型，72 h后尾部取血，以血糖＞16.7 mmol/L以上，定为糖尿病模型，未达标准者予以剔除(n=2)，20只大鼠按饲养时间分为DM 6周、DM 12周组，余10只试验大鼠为对照组，用适量柠檬酸/柠檬酸钠溶液腹腔注射，实验过程中不使用胰岛素及其他降糖药物。

1.3 实验方法 所有大鼠于河南省实验动物中心饲养室分笼饲养，每笼1只，以标准大鼠饲料(购自河南省实验动物中心)喂养，自由饮水。饲养室内保持良好通风，室温18～22℃、相对湿度45% ～65%。各组大鼠在相应时段分批用代谢笼收集24 h尿液，测定24 h尿白蛋白排泄量;禁食12 h后用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，于腹主动脉采血，分离血清，测血糖、血肌酐水平。同时取出右侧肾脏，去掉被膜，滤纸吸干血迹后称重，留取一部分肾脏置于4%的甲醛固定液中，以待免疫组化检查，剩余部分置于液氮中，再转入－80℃冰箱保存以备提取RNA。

1.4 组织病理及免疫组织化学染色 肾脏组织用4%的甲醛溶液浸泡24 h，然后石蜡包埋后切成4 μm厚的薄片用来做HE染色和免疫组化。GRP78和Caspase12的检测用SP法，按说明书步骤操作:脱蜡、漂洗、抗原修复、消除内源性活氧化物酶，滴加封闭液，弃封闭液分别加抗 GRP78抗体和抗Caspase12抗体(羊抗大鼠多克隆抗体)，再加生物素标记的第二抗体与链亲和素—过氧化物酶溶液漂洗，DAB液染色，苏木素复染，用已知阳性结果作为阳性对照，用PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照，应用BioSens digital imaging图象分析软件进行分析，每张标本随机选取5个视野，计算平均光密度值来进行统计分析。

1.5 细胞凋亡检测 用原位末端标记凋亡细胞(TUNEL法)检测，按照原位凋亡试剂盒(TACSTMTDT Kit)进行操作。光镜下正常细胞核呈蓝色，凋亡阳性细胞核呈棕黄色。细胞凋亡指数(AI)的计算:每张阳性切片选取5个阳性细胞最多的高倍视野(400×)，计算500个肾脏细胞中阳性细胞所占的百分比。肾脏AI=500个肾脏细胞中阳性细胞数/500个肾脏细胞细胞总数。

1.6 半定量RT-PCR法 取肾脏组织100 mg加入1 mL Trizol充分均浆及弹打均匀提取总RNA。于紫外分光光度计上测定260 nm和280 nm波长处OD值，OD260/OD280在1.6 ～2.0 为所需 RNA 纯度，计算其含量。逆转录为cDNA，以此为模板进行PCR扩增，GRP78引物序列为:5'-GACCATGGAGAAAGCTGTAGAGA-3'，5'-CCAAGACACGTGAGCAACTGCTA-3'扩增长度为373 bp;Caspase-12引物序列为:5'-TGGAGGTAAATGTTGGAGTG-3'，5'-GCTTGTGGATACCCAAATAG-3'，扩增长度为584 bp;内参 β-actin的引物序列为:5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'，5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'，扩增长度为207 bp。扩增条件如下:94℃预变性2 min，1个循环;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30个循环;72℃总延伸6 min。分别取PCR产物与缓冲液混合，经2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140图像记录分析系统进行分析，目的基因mRNA的表达量以目的基因DNA条带和β-actin的 DNA条带灰度值比值计算。

1.7 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行统计分析，计量资料以¯x±s表示，数据统计采用方差分析及独立样本的t检验，相关性分析采用直线相关分析。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 大鼠的一般情况 实验过程中，对照组大鼠精神状态良好，反应敏捷，体质量增加明显，毛色白而光泽。DM组大鼠出现被毛无光泽、饮水量偏多、尿量多、多食、体质量偏轻，并随着时间的延长，上述症状、体征加重，其中2只出现采血处溃烂(经局部消毒后好转)。

2.2 生化指标比较 与对照组比较，DM模型组血糖、血肌酐、24 h尿蛋白排泄量均高于对照组(P＜0.05);与DM 6周组比较，DM 12周组血肌酐、24 h尿蛋白排泄量均增高(P＜0.05)，而血糖在两组之间无统计学差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血糖、尿蛋白排泄量、血肌酐的比较(¯x±s)

2.3 肾脏组织病理学改变 HE染色显示发现，对照组大鼠肾组织结构完整，分层清晰，细胞形态比较完好;DM 12周组大鼠肾脏横切面可见肾小球体积增大，基底膜增厚，系膜基质增多，分层紊乱，肾小管上皮细胞小灶样萎缩，小动脉管壁增厚等，DM 6周组大鼠上述病理改变较轻。

2.4 原位细胞凋亡及免疫组化检测 TUNEL阳性染色信号定位于肾脏细胞核内，呈棕黄色，体积等于或小于正常细胞核;正常细胞核呈淡蓝色。正常大鼠肾脏偶见细胞凋亡，DM 6周、DM 12周组大鼠凋亡细胞逐渐增多，在肾小球和肾小管中均可观察到。DM 6周组肾脏细胞的AI高于对照组(P＜0.05)，DM 12周组肾脏细胞的AI高于DM 6周组(P＜0.05)。免疫组化检测肾脏组织中存在 GRP78、Caspase12蛋白，阳性表达部位染色呈棕黄色，两者的表达部位基本一致，主要位于肾小球、肾小管和间质部位。对照组有少量表达，DM 6周组表达升高，DM 12周组升高更明显(P＜0.05)。见表2。

表2 肾脏细胞AI与GRP78及Caspase12的表达(¯x±s)

2.5 RT-PCR结果 DM 各组 GRP78、Caspase12 mRNA的表达较正常对照组增加(P＜0.05)，DM 12周组高于DM 6周组(P＜0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肾脏组织GRP78和Caspase12 mRNA相对表达量(¯x ±s)

2.6 相关性分析 GRP78蛋白表达与24 h尿蛋白排泄量、血肌酐、Caspase12的蛋白表达、肾脏AI正相关(r=0.896、0.937、0.841、0.896，P=0.043、0.015、0.015、0.038).

3 讨论

DN的发病机制尚不完全明确。文献研究表明，细胞凋亡作为一原发和独立的因素在DN的发病过程中起到不可忽视的作用［5］。细胞凋亡在DN早期可能对清除增生的多余细胞是有益的，但DN晚期肾脏细胞凋亡细胞数目往往与肾功能恶化程度呈正比。

内质网是重要的细胞器，它在蛋白质的合成、翻译后修饰、折叠组装等方面起重要作用。缺氧、氧化应激、内质网内Ca2+耗竭、蛋白质加工异常、某些蛋白表达过多等各种刺激可能引起内质网机能障碍，激活未折叠蛋白反应(UPR)，导致ERS［6］。适当的ERS可通过促进蛋白折叠、抑制蛋白合成来适应应激，但ERS持续存在或强度过大超过内质网所能承受的范围时，则会对细胞造成损伤或触发细胞凋亡信号途径，诱导细胞的凋亡［7］。GRP78是ERS反应的标志性分子，半胱氨酸蛋白酶Caspase12途径是内质网特有的凋亡途径［8］。Paschen 等［9］在 1996年提出内质网的功能紊乱同细胞凋亡密切相关。Cybulsky等［10］强调ERS在肾小球损伤中的作用，认为无论体外还是体内因素刺激足细胞都可以诱导ERS。Toshiyuki等［11］将细胞破碎超速离心分为核、线粒体、微粒体(内质网膜)、溶解碎片，经免疫组织化学和Western印迹证实Caspase家族中仅Caspase12存在于内质网膜上。Mouw等［12］发现，敲除Caspase12的细胞虽然仍对其他各种凋亡诱导因素敏感，但对ERS诱导的凋亡却产生耐受。Rammohan等［13］发现Caspase12缺陷鼠能抵抗ERS引起的凋亡，而其他死亡刺激仍可发生凋亡，这表明Caspase12与ERS介导的凋亡密切相关，与不涉及ERS的凋亡信号通路无关。因此ERS介导的细胞凋亡是不同于死亡受体及线粒体途径的一种新的细胞凋亡途径。

我们的研究通过构建STZ DM大鼠模型，通过检测DN大鼠相关生化指标及肾脏组织中ERS标志分子GRP78及特有的相关凋亡因子Caspase12的动态性表达，来研究DN不同时期肾脏细胞的应激能力及相关的肾脏细胞凋亡情况与肾脏病变的程度的关系。结果发现，DM组24 h尿蛋白排泄量、血肌酐值较正常对照组明显增加，同时随着病程的延长，与DM 6周组比较，DM 12周组24 h尿蛋白排泄量、血肌酐值也相应增加;TUNEL法检测DM组大鼠肾脏细胞的AI显著高于对照组，且随着病程的延长肾脏细胞的凋亡程度逐渐增加;研究还发现，在正常大鼠肾脏组织中，免疫组织化学和RT-PCR结果提示，GRP78和Caspase12有少量表达，主要分布在肾小球细胞及肾小管上皮细胞，在间质细胞也有表达，DM组大鼠肾脏组织中GRP78和Caspase12的表达较正常对照组明显增高，并随着病程的延长，GRP78和Caspase12的表达也相应增加，这表明ERS已被启动，相关的细胞凋亡也相应出现，且与DM病程相关;同时GRP78蛋白的表达与肾脏细胞的凋亡程度、血肌酐水平、24 h尿蛋白量之间均呈正相关。

本研究结果提示，GRP78和Caspase12的动态表达可能与DN的进展密切相关，提示DM大鼠体内肾脏组织中ERS介导的凋亡途径被激活。同时也提示内质网相关的凋亡与肾脏细胞的丢失有关，且随着病程的延长，肾脏细胞的凋亡逐渐增加。这也提示了一种通过抑制内源性GRP78和Caspase12生成来延缓DN发展的新思路。DN的发病机制是多因素、多途径的结果，若早期在ERS环节上加以干预，有可能为延缓DN的发展提供新的治疗途径。因此，临床上可以采取相应措施，从而在某种程度上抑制肾脏细胞调亡，降低DM肾脏损害。

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