甲型流感病毒H1N1亚型HA基因的克隆及序列分析

钟媚共，邱贤秀，向阳飞，吴崇超，王一飞

(1暨南大学生物医药研究开发基地，广州510632;2暨南大学药学院)

甲型流感病毒H1N1亚型是人类最常感染的流感病毒之一［1］。然而，目前对此种结合猪流感、人类流感的新病毒的流行病学了解很少。流感病毒表面血凝素(HA)是流感病毒合成的重要蛋白，病毒通过包膜上的HA吸附在宿主细胞表面，在蛋白酶的作用下，HA构象改变，病毒包膜与内体膜融合，脱壳，侵入细胞［4］。因此，HA蛋白是抗流感病毒药物研发的关键靶点。同时，HA具有亚型特异性，可诱导特异性抗体的产生［5］。HA基因非常容易发生抗原漂移，可引起致病性更强的新型流感病毒出现［6］，使待测病毒与标准检测抗体的交叉反应性差，疫苗的防治效果也难以达到预期，这给检测及防治工作带来极大的困难。我们于2011年11月～2012年8月进行本研究，克隆甲型流感病毒H1N1亚型血凝素HA基因，并对其进行序列分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与病毒 犬肾传代MDCK细胞购自美国ATCC公司，由本实验室保存;甲型流感病毒Influenza A/WSN/33(H1N1)由日本长崎大学生物医学研究生院分子微生物和免疫学系传染性病原体分子生物学实验室馈赠，病毒在鸡胚中活化增殖后，其滴度为10－4TCID50/mL，实验用100 TCID50/mL。

1.1.2 菌种及载体 E.coli DH5α 菌株购自Promega公司，由本实验室保存;载体pET 28a(+)质粒购自Novagen公司。

1.1.3 试剂 细胞培养用的MEM培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司;用于病毒总RNA提取的TRIzol试剂购自Invitrogen公司;DEPC水购自广州斯佳生物有限公司;逆转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit、DL 2000 DNA Marker、DL 5000 DNA Marker、1 kb DNA Marker、限制性内切酶 Hind Ⅲ和XhoⅠ及T4 DNA连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;KOD Plus Neo购自TOYOBO公司;胶回收及质粒小量抽提试剂盒购自OMEGA公司;TRYPTONE和YEAST EXTRACT购自OXOID公司;引物合成及重组质粒的测序均由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.1.4 仪器 电热恒温隔水式培养箱及生化培养箱购自湖北黄石市医疗器械厂;倒置相差显微镜购自日本Olympus;低温高速离心机购自德国Hettich公司;核酸蛋白分析仪购自 Beckman Coulter;PCR扩增仪购自美国MJ Research;凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司;电泳仪购自北京六一仪器厂;台式高速离心机购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank中公布的A/WSN/33流感病毒血凝素基因序列(GenBank Accession No.J02176.1)设计引物。上游引物P1:5'-CCCAAGCTTATGAAGGCAAAACTACTG-3'，下 划线部分为 HindⅢ酶切位点;下游引物 P2:5'-CCGCTCGAGTCAGATGCATATTCTG-3'，下划线部分为XhoⅠ酶切位点。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。加三蒸水溶解引物使之终浓度为10 μmol/L，－20 ℃保存。

1.2.2 病毒RNA的提取 MDCK细胞培养至单层，加入病毒液，37℃、5%CO2培养至当75%以上细胞出现病变时弃去培养液，按10 cm2细胞/mL TRIzol的比例加入TRIzol试剂，室温放置5 min，使细胞充分裂解，按照试剂说明提取病毒总RNA［7］。

1.2.2 HA基因的PCR扩增与纯化 利用Prime-Script RT reagent Kit的方法进行反转录，获得cDNA为模板PCR扩增病毒HA基因，PCR反应体系如下:32 μL ddH2O，5 μL 10 × PCR buffer for KOD Plus Neo，3 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5 μL P1，1.5 μL P2，5 μL 2 mmmol/L dNTPs，1 μL KOD Plus Neo，1 μL cDNA。反应条件为:94℃ 2 min、98℃ 10 s、61℃30 s、68℃ 50 s，29个循环，4℃至结束。1%PCR产物用琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收试剂盒回收纯化目的片段。

1.2.3 重组质粒的构建 根据质粒小量抽提试剂盒的方法抽提pET 28a(+)质粒，抽提产物－20℃保存。目的基因和pET 28a(+)质粒经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收酶切产物，然后按照T4 DNA连接酶的反应体系16℃连接过夜。

1.2.4 转化及重组质粒鉴定 将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，取100 μL转化菌液涂布于含1‰卡那霉素的LB培养基琼脂平板上，37℃倒置平板培养过夜。挑取单克隆接种于含1‰卡那霉素的液体LB培养基中，摇菌培养过夜。取200 μL单克隆菌液，离心，弃去培养液后用三蒸水重悬，100℃煮沸10 min后进行菌液PCR;剩余的菌液用质粒小量抽提试剂盒抽提重组质粒，进行HindⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定。PCR产物和双酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，菌液PCR和双酶切鉴定正确后送华大基因科技股份有限公司测序。测序结果用NCBI平台上的BLAST工具进行序列比对分析。

1.2.5 生物信息学分析 利用生物信息学方法对病毒HA基因进行分析:编码阅读框的预测采用ORF finder程序完成;蛋白的基本理化性质分析用Expasy的 ProtParam程序;蛋白疏水性计算用ProtScale程序;跨膜结构用TMHMM程序预测;信号肽预测经SignalP4.0程序进行;二级结构的预测用SOPMA方法进行;亚细胞定位用PSORT程序;蛋白的功能分类用ProtFun服务工具预测。蛋白的糖基化位点预测用NetNGlyc1.0服务程序完成。

2 结果

2.1 病毒HA基因的PCR扩增 将提取的总RNA反转录为cDNA后，以该cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，在1 500～2 000 bp处获得1条特异性扩增的条带，大小约为1 700 bp。

2.2 HA基因的克隆与鉴定 目的基因经HindⅢ和XhoⅠ双酶切及电泳回收后定向插入同样双酶切回收的pET 28a(+)质粒，转化DH5α后挑取阳性单克隆进行菌液PCR鉴定，在约1 700 bp处有一特异性条带;摇菌提取质粒进行HindⅢ和XhoⅠ双酶切鉴定，得到载体条带和目的基因条带。见图2。

图1 PCR合成HA的DNA序列

图2 重组pET 28a(+)-HA质粒限制酶分析

2.3 HA基因的序列分析 将初步鉴定正确的重组质粒送华大基因科技股份有限公司测序，测序结果表明重组质粒pET 28a(+)-HA成功构建，HA基因含1 698 bp的编码区，编码565个氨基酸。所得基因序列与GenBank上已登录的甲型流感病毒WSN/33(H1N1)的HA基因序列进行比对，序列相似性达99%。两个序列编码的氨基酸序列比对后发现，其同源性同样为99%，氨基酸残基有1个位点存在差异，为399位G/R。此外两个氨基酸序列都具有相似的保守区域，因此推断本研究获得的基因为病毒的HA基因。

2.4 生物信息学分析 对HA基因进行ORF finder分析，发现其mRNA序列中第33到第1 730个碱基之间存在1个1 698 bp的开放阅读框。利用Expasy的ProtParam程序分析H1N1血凝素蛋白的基本性质，结果显示HA基因编码565个氨基酸，其中酸性氨基酸(Asp+Glu)有59个，碱性氨基酸(Arg+Lys)有56个，蛋白分子式为C2824H4359N765O856S25，相对分子量为 63 524.7 dal，理论 pI值为6.55;不稳定系数37.18，表明该蛋白较为稳定;总平均亲水性为－0.379，是一个亲水蛋白。运用ProtScale分析HA蛋白，得到其亲/疏水性图谱，结果HA蛋白中亲水性氨基酸明显较多，在整个氨基酸序列中均匀分布，整个多肽链表现为亲水性，与Protparam分析结果一致。用TMHMM程序预测HA蛋白的跨膜区，发现HA蛋白中可能存在一个跨膜结构。SignalP4.0信号肽预测结果显示，HA蛋白有一个信号肽结构。SOPMA分析结果显示，血凝素蛋白的二级结构包括不规则卷曲(39.29%)、α-螺旋(32.21%)、延伸链(22.30%)和 β-转角(6.19%)4 种形式，卷曲结构和螺旋结构散布于整个蛋白质中，构成HA蛋白二级结构的骨架。通过PSORT程序分析HA蛋白的亚细胞定位，发现HA蛋白最可能定位于病毒包膜上。通过CBS的Protfun工具预测分析HA蛋白的功能，结果显示其为病毒包膜的组成成分。糖基化位点预测分析结果显示，HA蛋白氨基酸序列共有7个 潜 在 糖 基 化 位 点，分 别 是-NNST-、-NSTD-、-NITG-、-NHTF-、-NASM-、-NGTY-和-NGSL-，位 于 第27、28、73、142、285、497 和 556 位，其中第 27 和 28位为重叠的糖基化位点。

3 讨论

2009年墨西哥、美国爆发H1N1疫潮，疫情其后蔓延到全世界［2］。2009年6月WHO将全球流感大流行警告级别提升至最高等级第6级［3］。

流感病毒是一种单负链RNA病毒，其基因组由8个节段组成，第4节段编码的血凝素蛋白HA是位于病毒囊膜表面的一种蛋白质［8］。HA可识别和结合靶细胞受体，参与细胞膜的融合，并可诱导特异性抗体的产生，因此，它在病毒的吸附和穿膜过程、病毒的致病力、宿主的特异性方面均起决定性作用，是目前研究最多和最深入的流感病毒基因［9～11］。

本研究结合分子生物学实验技术和生物信息学分析方法，用RT-PCR法获得甲型H1N1流感病毒血凝素HA基因序列，然后将其与pET 28a(+)质粒连接，通过PCR扩增、酶切和序列测定证实重组质粒构建成功。应用生物信息学对HA蛋白的理化性质、疏水性、二级结构、功能结构域、蛋白功能和同源性等进行预测分析，显示HA基因开放读框为1 698 bp，编码565个氨基酸，其中酸性氨基酸(Asp+Glu)有59个，碱性氨基酸(Arg+Lys)有56个。编码的蛋白亲水性氨基酸较多，存在一个跨膜结构和信号肽，最可能定位于病毒包膜上。本研究工作有助于深入研究HA在病毒复制周期中的作用和意义，为流感病毒的快速准确检测以及制备基因工程疫苗奠定基础。

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