激动GHB受体对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制探讨

杨其侠，秦 浩，郝 伟，贺大伟，谷淑玲

(1徐州医学院，江苏徐州221002;2枣庄市立医院;3枣矿集团中心医院)

γ-羟基丁酸(GHB)是脑内天然存在的抑制性神经递质或调质，能自由通过血脑屏障。它由GABA转化而来，其化学结构与GABA相似［1］。多项研究证实脑内存在特异性GHB受体。哺乳动物脑内GHB受体呈现不均匀分布，它专一表达于包括额叶皮层在内的整个大脑皮层、纹状体、嗅束、丘脑及A9、A10、A12等多巴胺能神经核团［2］。最近的报道称在大鼠脑内已克隆出GHB受体的cDNA［3］，并证实GHB受体属于G蛋白偶联受体(GPCR)大家族且存在多种亚型［4，5］。但关于 Gi蛋白在激动 GHB受体对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用中的变化，目前尚未见报道。我们于2008年3月～2010年7月进行本实验，采用GHB受体选择性激动剂NCS-356作为工具药，观察Gi蛋白在激动GHB受体对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤保护作用中的变化。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 NCS-356，Sigma公司产品;Gi抗体，Sigma公司产品;AP标记羊抗兔血清二抗，北京中杉公司。江湾Ⅰ型C立体定位仪，上海第二军医大学修配厂;752紫外分光光度计，上海分析仪器厂;图像采集及分析系统，德国Leica Qwin。

1.2 动物分组及模型制备 40只清洁级SD大鼠，体质量约250 g，随机分为5组，分别是假手术组，缺血再灌注(I/R)组，NCS-356 160、320 和 640 μg/kg组。假手术组只分离动脉，不结扎、插线。其余组参照改良Longa法［6］制备缺血再灌注模型，具体方法:10%水合氯醛腹腔注射麻醉，颈部手术区备皮，70%乙醇消毒，颈部正中切口，右侧颈动脉鞘处分离颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉，结扎翼腭突动脉、ECA及CCA，在CCA结扎处远心端剪一斜切口，插入栓线(直径0.20 mm单股尼龙线50 mm，将头端加热成球形，在光镜下成光滑圆球，于线端18.5 mm处作标记)，进线17～21 mm时，感到明显阻力，证明栓线头端已达大脑中动脉起始处，开始计算缺血时间，在CCA插口结扎、固定栓线，逐层缝合。2 h后拔出栓线，即可得到前后交通动脉血供，此为再灌注期。模型制作成功的判定参照Longa 5分制评分标准进行神经功能评分，实验过程中死亡或大出血、评分为0分和4分者均被剔除。

各组大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，矢状切开头皮至颅骨，以前囟为基点，后移1.5 mm、右移1.5 mm处钻开颅骨，以颅骨表面为准，垂直进针4.5 mm，各组分别用微量注射器将10 μL药物，假手术组不注射任何药物，I/R组注射生理盐水，NCS-356 160 μg/kg 组注射 NCS-356 40 μg，NCS-356 320 μg/kg 组注射NCS-356 80 μg，NCS-356 640 μg/kg 组注射 NCS-356 160 μg，均以 0.35 μL/min 速度注入大鼠侧脑室，注射后留针10 min，再撤出微量注射器，骨蜡封闭小孔，常规局部消毒，缝合切口。40只大鼠脑缺血再灌注24 h处死后，取新鲜缺血脑皮层组织约100 mg(取视交叉前后约5 mm的缺血脑皮层组织)置于－70℃冰箱，Western blot法测定Gi水平。

1.3 神经功能评分 大鼠缺血再灌注24 h后采用5分制法［7］进行神经功能评分:①前肢蜷曲:提起大鼠尾巴时无屈曲症状者0分，轻度左前肢偏瘫肩内收者0.5分，中度或重度左前肢偏瘫肩内收者1.0分;②抗侧推能力:自大鼠肩后向两侧推挡，阻力一样者0分，阻力轻度减弱者0.5分，没有阻力者1.0分;③身体转圈:提起大鼠尾巴无转圈者0分，向瘫痪侧有轻度转圈者0.5分，中度以上并有身体转圈者1.0分;④自主活动的程度:大鼠活动正常者0分，自主活动较正常减少者1.0分，活动需要激惹的1.5分，失去自发活动能力者2.0分。大鼠评分为0分的予以剔除，并随机补充，保证每组8只大鼠。分值越高说明大鼠行为障碍越严重。

1.4 Western blot法测定Gi含量 分别取各组样品加入匀浆液进行匀浆，采用紫外吸收法进行蛋白含量测定。将蛋白处理液加入样品中，100℃或沸水浴加热3～5 min，以充分变性蛋白。处理好的样品置于－20℃冰箱中保存备用。采用5%的浓缩胶和10%聚丙烯酰胺分离胶，每孔加入30 μg蛋白样品，置电泳缓冲液中，100 V电泳，条带压缩整齐后调至200 V，电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近停止电泳。将凝胶上的蛋白条带转移到NC膜上，蛋白膜放置到Western洗涤液中漂洗，再将转移好的NC膜放入封闭液中摇床上室温封闭1 h，吸尽封闭液后取出NC膜，放入1∶200兔抗大鼠Gi抗体液中摇30 min，再放4℃冰箱过夜。次日回收一抗，洗膜，加入1∶30 000 AP标记羊抗兔二抗稀释液，振摇1 h，回收二抗，洗膜，将NC膜放入含NBT和BCIP的显色液中，摇晃显色，将显色后的NC膜扫描，留做条带灰度分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计分析，数据以¯x±s表示，多组间比较采用完全随机设计方差分析法(ANOVA)，多组间两两比较采用q检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

大鼠神经功能评分及Gi含量检测结果见表1。

表1 大鼠神经功能评分及Gi含量检测结果(¯x±s)

3 讨论

Snead［4］发现GHB诱导由G蛋白介导的腺苷酸环化酶(AC)的减少是通过G蛋白偶联的突触前受体介导的，Ratomponirina也发现GHB受体结合位点能特异性被鸟苷酸和百日咳毒素所阻断，以上结果支持脑内GHB受体属于鸟嘌呤核苷酸(如Go或Gi)受体家族［5］。GHB 的钠盐 γ-羟丁酸钠(SO)已被证实对大鼠缺血脑皮层神经元有保护作用，且SO的脑保护作用与激动GHB受体有关［8～11］。我们前期的研究证实，SO对大鼠局灶性脑缺血、沙土鼠全脑缺血和培养大鼠缺氧复氧皮层神经元具有神经保护作用，并初步证实该作用与GABA及其受体亚型有关［9，10］，但 GABA 受体阻断剂仅能部分对抗 SO对脑缺血的保护作用，提示SO的脑保护作用不仅与GABA受体有关，可能还有其他的机制参与。我们在大鼠海马脑片上发现，GHB受体特异性阻断剂NCS-382也可部分对抗SO的脑保护作用，提示SO对脑缺血的保护作用既与激动GABA受体有关，又与激动GHB受体有关［11］。这为探讨GHB受体在缺血性脑损伤中的作用奠定了很好的基础。因此进一步探讨GHB受体在缺血性脑损伤中所起的作用，以及在缺血性脑损伤中GHB受体可能的信号转导通路很有必要。

本研究结果显示，激动GHB受体可以改善大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤引起的行为功能障碍，进一步证实了本实验室及其他实验室先前的结论［11］。实验结果还显示，I/R组大鼠缺血侧大脑皮质Gi水平明显低于Sham组，说明大鼠脑皮层细胞Gi水平改变可能参与了大鼠脑缺血再灌注的分子生物学发病机制。大鼠脑缺血前和再灌时给予GHB受体激动剂NCS-356，能升高大鼠脑缺血再灌注后皮层细胞的Gi含量，且随其剂量的增加作用增强。以上结果提示，在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中激动GHB受体产生的脑保护作用与其激动Gi蛋白有关。

GPCR是研究最为广泛的一类受体，他们组成不同功能的超大家族，目前已知的GPCR已多达1 000多种，而且数量还在增加。G蛋白是近年来在生物细胞膜发现的一组与三磷酸鸟苷(GTP)相结合的蛋白质，其主要功能是将激素或神经递质信息由细胞膜外的受体传递至细胞膜内表面的效应器，在神经细胞的生长、分化、代谢及功能活动中发挥十分广泛而基础的作用，是胞外信号的转导子和放大器，起着“分子开关”的作用。Gi是一种抑制性G蛋白，其信号转导通路为Gi抑制AC的激活，从而抑制了AC催化ATP生成cAMP，进而抑制PKA的激活与p-CREB的生成。

在SO对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用中，可能是SO与细胞表面的Gi蛋白偶联受体结合激活腺苷交换，G蛋白的α亚基和β、γ亚基复合体解离，解离后的α亚基抑制AC活性，从而改变细胞内第二信使如cAMP的水平，影响蛋白激酶活性进而影响特定蛋白磷酸化及基因表达。

GHB受体作为一种G蛋白家族偶联受体，由于存在不同类型的G蛋白亚基，不同亚基通过不同通路产生不同的生物学效应，而本实验仅研究了Gi蛋白在激动GHB受体对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用中的含量变化，希望进一步完善GHB对大鼠脑缺血保护作用的分子机制，为临床治疗缺血性脑损伤提供一个新的药靶。但是脑缺血再灌注性损伤发病机制复杂，要全面了解激动GHB受体对脑缺血的保护作用机制还需做进一步深入的研究。

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