外周血CD3+T细胞中CD166的表达在初诊结直肠癌诊断中的应用

谭冬梅，邓慧兰，胡淑芬，郭秀仪，黄福喜

（广州市番禺区中心医院检验科1，肿瘤科2，广东 广州 511400）

结直肠癌(CRC)是我国常见恶性肿瘤之一。大多数有临床症状的CRC患者确诊时已是疾病的中晚期，这是治愈率低、致死率高的一个主要原因。所以疾病的早期诊断显得尤为重要。近年，国内外众多研究团队都在寻找一种简单而有效的早期诊断方法。而运用分子生物学研究肿瘤已成为当今潮流，寻找有价值的分子标志物，可早期发现某些肿瘤。本实验研究CD166在结直肠癌患者外周血CD3+T细胞中的表达情况，探讨其作为早期筛查结直肠癌的分子标志物的可能性，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 一般材料 选取2011年1月至2013年2月在广州市番禺区中心医院住院和门诊的结直肠癌病例167例作为观察组，所有患者未经放疗和化疗，所有病例均经病理切片确诊，全部病例按VICC肿瘤分类标准进行组织学分型及TNM分期，收集这些患者的外周血液标本。同时选取134例排除有结直肠癌家族史、便血的健康体检者外周血液标本作为对照组。

1.2 方法

1.2.1 仪器试剂 仪器使用BD流式细胞仪FACSCANTOⅡ(BD公司)，BD公司配套试剂：MOUSE LG1 PE；MOUSE LG1 APC；MOUSE Anti Human CD166PE(克隆号：3A6)；CD3APC(克隆号：SK7)；质控品：Rainbow Fluorescent Particles(BD公司)。

1.2.2 操作方法 两组均按流式细胞术常规操作进行：(1)静脉采血2 ml，EDTA-K抗凝管抗凝；(2)开机进行Set up，并做质控；(3)两组标本均设各自同型对照，将标本摇匀，吸取50 μl全血于流式专用试管中，同型对照管加入 MOUSE LG1 PE 5 μl，MOUSE LG1-APC 5 μl；测定管加入 CD166-PE 5 μl，CD3-APC 5 μl；混匀后，避光保存15 min；(4)加入溶血素 2 ml，混匀后，避光10 min；(5)离心5 min，弃上清液；(5)加入0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)2 ml，离心5 min，弃上清液；(7)加入250 μl PBS，混匀，上机；(8)同型对照管调节电压，用CD3-APC/SSC设门，检测CD3阳性细胞群中CD166细胞平均荧光强度。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，本组资料为偏态分布，经方差齐性检验得出方差不齐，采用两独立样本的Wilcoxon秩和检验进行比较，以P＜0.01差异有统计学意义。

2 结果

收集直肠癌患者及健康人群中10 000个CD3阳性细胞设门见图1，测定健康人群中10 000个CD3阳性细胞的CD166PE-A的平均荧光强度见图2，测定病例组中10 000个CD3阳性细胞的CD166PE-A的平均荧光强度见图3。再统计分析所有健康人群组及直肠癌病例组的CD166PE-A平均荧光强度见表1，健康人群组CD3+T细胞上CD166PE-A的平均荧光强度为(125.69±21)道数，结直肠癌观察组外周血中CD3+T细胞上CD166PE-A的平均荧光强度为(171.31±42)道数，两组比较，Z值为4.519，差异有显著性统计学意义(P＜0.01)。

图1 CD3APC-A的荧光强度为横坐标，侧角光(SSC)为纵坐标，P2为1 000个CD3阳性细胞设门

图2 横坐标为CD166PE-A的平均荧光强度，纵坐标为细胞分布频数

图3 横坐标为CD166PE-A的平均荧光强度，纵坐标为细胞分布频数

表1 CD166在结直肠癌患者及健康人群中的表达和统计分析(±s)

表1 CD166在结直肠癌患者及健康人群中的表达和统计分析(±s)

组别 例数CD166平均荧光强度(道数)Z值P值结直肠癌患者健康人群167 134 171.31±42 125.69±214.519＜0.01

3 讨论

CD3+T是成熟T淋巴细胞的共同分化抗原，抗肿瘤免疫中发挥重要作用[1]。近年来研究表明T淋巴细胞在肿瘤抗原的识别、呈递等方面都担负着极其重要的作用。CD3+T细胞作为肿瘤侵润淋巴细胞的重要成分之一，已在结直肠癌的研究中被证实与肿瘤的进展和预后有关[2-4]。有研究表明大肠癌组织中存在肿瘤干细胞(TSC)，而CDl66被认为是TSC的标记物[3]，常表达在活化的T淋巴细胞上，作为T淋巴细胞表面的细胞其中之一的表型，其表达水平与肿瘤的关系已成为目前研究的热点[5-6]。故本课题是试图通过检测外周血CD3+细胞中CD166的表达水平来反映直肠癌患者的抗肿瘤免疫反应，从而探索外周血CD3+细胞中CD166的表达水平作为直肠癌早期诊断指标的可能性。

从本实验的实验结果来看，初诊结直肠癌患者组血液中CD3+T细胞上CD166平均荧光强度总体均数高于健康对照组，两者差异有统计学意义。结直肠癌患者的外周血中CD3+T细胞上CD166的平均水平的增高可能与宿主的抗肿瘤免疫反应有关，特异性反应在的CD3+T淋巴细胞上[7]。有研究提示CD166在结肠正常组织中不表达，而在腺瘤到腺癌的过程表达量明显增加，从正常组织到瘤，再到癌的过程中，CD166的表达量呈持续上升，证明其参与了结直肠癌的发生[8]。伴随着CD166表达水平的增强，肿瘤细胞增殖指数明显升高，证明CD166可促进肿瘤细胞的生长[9]。CD166在结肠癌细胞的胞膜和胞浆中均有表达，且它们的表达存在中度相关，推测它们在促进肿瘤细胞的侵袭活动中可能存在某些共同通路或因果关系，从而推断CD166在结肠癌细胞的活动中可能起着促进作用[10]。当CD3+T细胞随血流进入肿瘤间质时，由于癌变细胞表面或胞膜内的CD166水平有明显变化，CD166作为一种肿瘤相关抗原通过CD3+T淋巴细胞的识别、呈递，随着肿瘤的发生、发展、侵袭转移，外周血中CD3+T细胞上CD166的平均水平也随之增高。

我们可以通过研究不同分期的结直肠癌患者的外周血中CD3+T细胞上CD166的平均水平，从而预测结直肠癌的发生、发展、侵袭转移。在结直肠癌患者没有症状或是症状轻微时，体内的分子标记已开始有变化时，外周血中CD3+T细胞上CD166的平均水平，为结直肠癌进行筛查、早期诊断提供证据，此举对结直肠癌的诊治产生重要影响。有研究表明结直肠癌组织中CD166的表达与结肠癌的预后呈负性相关，低分化癌中有着更明显的表达，是判断预后的前兆因子[11]。动物实验表明抗CD166的单链抗体可抑制裸鼠结肠肿瘤的生长，据此可推测抗CD166抗体在人结肠癌的靶向治疗中的应用有着广泛的前景[12-13]。故本课题可进一步研究外周血中CD3+T细胞上CD166水平与结直肠癌预后的关系，以及靶向治疗的疗效监测研究。

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