河毒素药理活性和热性质密度泛函研究

秦文杰，钟爱国

（浙江省台州学院医药化工学院， 浙江 台州 316000）

1970 年Tamura 等报道了TTX-氢溴酸盐的晶体结构[1,2]，潘心富等于1979 年首次由河豚卵巢中分离提取出 TTX[3]。在理论计算方面, 陈常英等[4]利用DPCILO 程序，采用半经验方法(INDO)优化了 TTX及其 5 个衍生物的结构及分子轨道, 并与化学结构不同但药理作用相同的石房蛤毒素(STX)进行了比较；赵永明等[5]探讨了TTX 及其23 种类似物的红外光谱和核磁共振图谱。TTX 是迄今为止人类在自然界中发现的最为奇特的小分子天然产物之一，不仅结构新颖而且性质独特，即使长时间高温加热亦不会破坏其化学结构或降低其毒性，但遇碱不稳定，易被破坏。TTX 的分子结构和原子编号如图1 所示。由于原料来源稀有，纯品昂贵，限制了它的实验研究。本文选用密度泛函方法在优化结构的基础上,得到其热力学函数并利用Fukui 指数和前线轨道理论，对其易发生的反应部位进行了理论预测，取得了有意义的结果。

1 计算方法

本文对河豚毒素分子采用 DFT 理论的 B3LYP方法在 6-311+G(d,p)基组水平上进行了优化计算。在优化得到的稳定构型基础上，采用Freq 方法进行了频率分析，结果表明所有简谐振动频率全部为正值，表明其计算结果是可信的。本项目的全部计算工作通过Gaussian03 程序在PC 机上完成。

图 1 河豚毒素(C11H17O8N3)分子结构和原子编号Fig.1 Tetrodotoxin (C11H17O8N3) molecular structure and atomic number

2 结果与讨论

2.1 几何结构分析

用Gaussian 03程序在B3LYP/6-311+G(d,p)水平上进行优化计算得到了河豚毒素分子的键长, 键角等与晶体实验值的比较示于表1[1,2]。

表1 优化后键长、键角的比较（键长:nm; 键角: °）Table 1 The bond lengths, bond angels, optimized (nm, °)

正常的C=N 双键的键长(0.134～0.138 nm), C-N单键(0.147～0.152 nm)，C-C 单键(0.154～0.162 nm),C-O 单键(0.120～0.143 nm), C=O 双键(0.121～0.123 nm), O-H(0.094～1.500 nm)。表1 中列出了优化后分子的部分键长数据表明：除C10-O18的键长稍微大一点外，其他键长均属于正常范围。结合分子结构图1 分析，对应的 C5-N12键(0.144 nm)和 C12-N15键(0.146 nm)的键长稍长于正常的C=N 双键(0.134～0.138 nm)，而与之相邻的 C10=N12双键的键长(0.126 nm)稍小于正常的 C-N 单键(0.147～0.152 nm)，符合胍基离域结构稳定的要求。表2 中列出的重要键角数据表明，由 C1-C2-C6-C13-C8-C3原子组成的六元环的夹角数据均在 109.0° 附近，而 C1-C2-C7-N15-C12-N5,C1-C2-C6-O14-C10-C5，C1-C4-C10-O17- C8-C3和 C6-O14-C10-O17-C8-C13杂环，夹角均在 107～118.0° 附近, 除C 原子受连接的O 和N 杂原子大的电负性作用使角度变型外，其余角度没有发生明显的扭曲变形。表1 的二面角数据表明：5 个六元环几乎处在椅式结构，这就有利于TTX 分子稳定，使得总能量降低。分子中的支链与环有明显的扭转而没有处在同一平面，这样的结构受位阻效应小有利于发挥官能团优势作用。

2.2 NBO 电荷

优化后TTX 分子中各原子的NBO 电荷分布见表2。

表2 TTX 分子的NBO 净电荷布居值Table 2 NBO net charge population value of TTX e

由于N 和O 原子的电负性比C 和H 原子大。因此, 在 TTX 分子中，3 个 N 原子(- 0.626 ～ -0.781e)和8 个O 原子(- 0.557 ～ -0.705 e)均带有净的负电荷。而且主环上N 和O 原子比氨基上的N 和羟基上的O 原子带有较多的负电荷, 这是因为它们较强烈地吸引相连的C 原子或H 原子上的电荷, 使其自身带上较大负电荷。除 C2原子外，其余C 和H 原子均带有正电荷, 且H 原子带有较大正电荷。 因主环上C 和N 原子正负电荷均不相等, 致使五个六元环主体带有少量的负电荷(0.04～0.05 e), 具有一定的亲水性。在由电荷控制的反应中, 原子的负电荷越多,其受亲电试剂进攻的可能性越大; 反之, 原子的正电荷越多, 则受亲核试剂进攻的可能性也越大. 因此推测胍基上的N19, N5，和N15原子很可能是亲电反应的作用点。

红外吸收光谱对研究分子的结构、化学键、表征和鉴别物质等有十分重要的作用。在结构优化的基础上, 在相同的计算水平上计算了TTX 的振动红外光谱。TTX 属于 C1点群, 有 39 个原子, 对应有94 个振动模式。理论计算所得到的部分特征振动频率(0～4 000 cm-1)及其红外强度列于图2。

图2 理论模拟TTX 的IR 谱Fig.2 IR spectrum of TTX2.3 IR 和 1HNMR 谱

在图2 谱图中，出现了TTX 的特征峰值: 3 502 cm-1(O-H，伸缩); 3 385 cm-1(N-H，伸缩); 1 766 cm-1(C=O 伸缩)；1 070～1 000 cm-1(伯醇，C-O 伸缩)；(1 120～1 030 cm-1仲醇C-O，伸缩); 1 170～1 100 cm-1(叔醇 C-O，伸缩)；1 275～1 020 cm-1（脂肪醚O-C-O，反对称伸缩）；1 098 cm-1(六元单氧环，伸缩); 1 640 cm-1(N-H，弯曲振动)和1 600 cm-1(一级酰胺的特征吸收峰); 1 550～1 530 cm-1(N-H，弯曲振动吸收)。在低频率范围内（<400 cm-1）还出现较多吸收峰，这主要由于六元环的 H 原子的特征指纹区[6-7]。理论模拟并指认TTX 核磁共振谱（见图3 所示）的峰特点较好地与其实验值吻合起来，也进一步验证了计算的准确性[8]。

图3 1HNMR 图谱指认Fig. 3 1HNMR spectrum of TXX

2.4 热力学稳定性

式(1)～(5) 显示了 TTX 的热力学函数计算结果与温度在25～1000 K 范围的对应关系。在298.15 K，熵(Sm)、热容(Cp,m)、焓(Hm)和自由能(Gm)的计算结果分别为 361.27, 142.19 J·mol-1·K-1和 343.31, 316.92 kJ·mol-1; 随温度升高, 熵(Sm)、热容(Cp,m)、焓(Hm) 等热力学函数均增大, 而自由能(Gm) 减小, 直到温度接近500 K 出现负值。通过对TTX 的计算热力学函数与温度的关系拟合, 我们得到了TTX 热力学函数与温度的关系式如下：

在整个温度范围内(25～1 200 K), T2的系数都很小, 因此其 4 个热力学函数与温度的倒数(1/T)近似呈正的线性关系。现假设TTX 脱水反应的焓变(Δ H)和熵变(ΔS)与温度关系不大为常数，则计算得到分解反应的吉布斯自由能变(ΔG)与温度成线性关系，意味着该脱水反应在高温下(520 K)能自发进行(ΔG<0)，为熵变驱动型反应(ΔS>0)。这与热重分析结果基本吻合。

2.5 极性和疏水参数

偶极矩和在正辛醇-水体系的分配系数(P)是用来表示药物亲脂性或疏水性的重要物理参数。我们使用 Gaussian03 程序计算获得 TTX 分子的偶极矩(3.368D)，为弱极性。这可能是由于TTX 的6 个醇羟基的存在，增大了TTX 的亲水性的缘故; 脂水分配系数(logP=996.16) 很大，表明其为一亲脂性的分子。另外，使用ACD/Lab 6.0 软件预测的TTX 在pH=7时的水溶解度 S=1.40×10-3mol·L-1，在pH=13 时突然增大。

2.6 反应活性

TTX 的亲电与亲核反应的Fukui 指数值列于图4。从图4 中数据可以看出, 最可能的亲电反应中心(f-)主要集中在3 个N 原子以及与之相连的H35，H32,H26以及 H28原子上, 主环整体不显电性, 尤其胍基N 原子上还含有孤对电子, 可与强酸如盐酸、硫酸、硝酸等都能形成盐; 亲核反应中心(f+)也主要在 N原子以及相连的H 原子上。因此, 遇到强酸或强碱溶液则分子会水解, 逐步被羟基取代, 最后生成开环结构。分子能隙ΔE(ELUMO-EHOMO) 的大小, 反映电子从最高占据轨道向最低空轨道发生电子跃迁的能力, 一定程度上可以代表其参加化学反应的活性。其差值越大, 分子稳定性越强; 反之分子越不稳定,越易参与化学反应。 TTX 的计算结果为EHOMO=-571.233 kJ·mol-1, ELUMO=13.797 kJ·mol-1, Δ E=585.03 kJ·mol-1。比较计算结果可知, 得到电子的能力较弱(ELUMO>0) , 因而生成河豚酸等衍生物的过程中, 胺基被羟基逐步取代; 失去电子的能力相对较弱(因为 EHOMO 很低), 因其胍基(C=NH)上的孤电子对, 能吸引 H+形成稳定的 C=NH2+, 所以它是一种弱碱(pKb=8.3)。能隙较大, 所以参加化学反应活性很弱。

图4 TTX 的Fukui 指数图Fig. 4 The atomic Fukui index of TXX

3 结 论

(1) 几何优化表明, 河豚素的 6 个六元环互成椅式构象，具有稳定的分子构型和良好的疏水参数，在碱性溶液中溶解能力强，红外光谱表征与官能团吻合较准确，核磁共振与其实验值基本符合；

(2) 在25～1 200 K 范围内，相应的热力学函数与温度的倒数呈正的线性关系，温度增加致520 K，脱水分解反应趋势增加，是受熵变驱动型反应；

(3) 通过 NBO 电荷分布, Fukui 指数和前线轨道分析, 我们推测分子活性最强的部位在胍基，胍基 N 原子孤对电子吸引酸的 H+显弱碱性的亲电反应; 与 N 相连接的 H 原子被碱性 OH-逐步取代生成开环衍生物的亲核反应。TTX 将主要通过这2 种方式来发挥其毒理和药理作用。

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［2］Tamura C.，Amakasu O.; Sasada Y.，Tsuda K. The crystal structures of derivatives of tetrodotoxin. II. Diaeetylanhydrotetrodotoxin Hydroiodide[J]. Acta Cryst, 1966, 21:226-236 .

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