步长脑心通通过下调ASIC1a发挥对局灶性脑缺血再灌注的保护作用

张楠，褚鹤龄，唐宇平，董强，任惠

（1.昆明医科大学第一附属医院 神经内科，云南 昆明 650000；2.华山医院 神经内科，上海200040）

近年来研究表明，步长脑心通在实验研究及临床治疗上对缺血性脑血管疾病的疗效明确[1-3]。脑缺血损伤机制中酸敏感离子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）[4]被激活导致胞内Ca2+超载，促使脑细胞的大量死亡。大量研究提示ASICs中ASIC1a介导了脑缺血中神经元的凋亡过程[5]。本实验采用大鼠短暂性大脑中动脉阻塞模型，研究步长脑心通对脑缺血再灌注损伤的作用及该作用是否通过调节ASIC1a实现。

1 材料和方法

1.1 主要试剂 脑心通超微粉（陕西步长制药有限公司），红四氮唑（TTC）染色液（美国Sigma公司），依文思蓝（EB）染色液（美国Sigma公司），末端脱氧核苷酸转移酶介导的duTP缺口标记（TUNEL）试剂盒（Roche公司，Mannheim，Germany），兔抗大鼠ASIC1a抗体（Adi公司），HRP标记的羊抗兔IgG（优宁维公司）。

1.2 实验动物、分组及模型建立 本实验采用健康雄性SD大鼠90只（上海斯莱克实验动物有限公司），体质量250～300 g。随机分为假手术组、MCAO组、脑心通组，每组30只。根据Zea Longa[6]改良线栓法建立大鼠暂时性大脑中动脉阻塞（tMCAO）模型，出现神经功能缺损视为造模成功。假手术组除不插线外，全过程等同对照组。90 min后拔线恢复再灌注，脑心通组给予步长脑心通超微粉0.5 g/（kg·d）（4 mL 0.9%氯化钠溶液溶解）灌胃（剂量根据预实验确定），假手术组、MCAO组给予等体积0.9%氯化钠溶液。术前3 d起给药，术后每天1次，直至处死。

1.3 神经系统疾病严重程度评分（NSS）每组大鼠于处死之前按照Chen等[7]的方法进行NSS评分，该评分是一种运动、感觉、平衡和反射功能的综合性评分指标。最低0分，1～6为轻度，7～12为中度，13～18为重度损害，最高18分。

1.4 测量梗死体积 在相应各时间点将各组大鼠断头取脑，迅速冰冻10 min，去除嗅球、小脑和低位脑干，连续切片成6片，每片厚度为2 mm，置于2% TTC液中染色30 min，4%多聚甲醛固定24 h后用数码相机照相。可见红色正常组织和白色梗死组织。用Image Tool 3.0软件计算梗死体积。

1.5 测定脑含水量 在相应各时间点将各组大鼠断头取脑组织，迅速除去嗅球、脑干、小脑，取梗死同侧半球。准确称得湿重后置100 ℃烤箱中烘烤至恒重后称取干重，根据以下公式计算脑组织含水量百分比：脑组织含水量=（湿重－干重）/湿重×100%。

1.6 测定血脑屏障通透性 在相应各时间点将各组大鼠经尾静脉注入2% EB液4 mL/kg，1 h后以10%水合氯醛3.5 mL/kg腹腔注射麻醉，心内灌注0.9%氯化钠溶液200 mL，迅速断头取脑，取梗死同侧半球称湿重后置于甲酰胺（1 mL/100 mg脑组织）中，60 ℃孵育24 h。1000 r/min离心5 min，吸取上清液置于比色杯中，紫外分光光度计比色（λ=632 nm），蒸馏水为空白对照液，测定上清液吸光度A值。根据已知EB浓度建立标准曲线，根据标准曲线求得EB含量（μg/g）。

1.7 TUNEL染色 将各组大鼠在相应时间点麻醉、开胸，用0.9%氯化钠溶液和4%多聚甲醛依次心内灌注固定。断头取脑，梯度脱水后用OTC包埋剂包埋，冷冻后，用冰冻切片机作连续冠状切片，片厚10μm。按照TUNEL试剂盒说明书操作。封片后在荧光显微镜下观察并拍照。在400倍高倍镜下随机观察并计数梗死周围6个不重叠视野的TUNEL阳性细胞，取其平均值作为计数值。

1.8 Westem blot法测ASIC1a表达水平 将各组大鼠于相应时间点处死，取缺血核心区脑组织提取总蛋白，考马斯亮蓝测定蛋白浓度，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶不连续电泳分离，转膜至硝酸纤维膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，再分别加入兔抗大鼠ASIC1a一抗孵育。4 ℃孵育过夜。再分别加入HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育1.5 h后，放入ECL反应液室温孵育5 min，以X线胶片曝光。免疫印迹的图谱经Image proPlus 5.02图像软件分析。

1.9 统计学处理方法 采用SPSS12.0统计软件，数据以±s表示。多组间用单因素方差分析与Newman-Kueuls检验，两组间比较用两样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分 假手术组动物无明显神经功能缺损，MCAO组、脑心通组均有不同程度的神经功能缺损。与MCAO组相比，脑心通组大鼠各时间点神经功能评分显著降低（P＜0.05）。见图1。

图1 各组不同时间神经功能评分比较（n=6）

2.2 梗死体积 假手术组无明显梗死灶。与MCAO组比较，脑心通组各时间点梗死体积均有显著减少（P＜0.05）。见图2。

图2 各组不同时间梗死体积比较（n=6）

2.3 脑含水量 与假手术组比较，MCAO组和脑心通组1、3和7 d脑含水量均有升高，与MCAO组比较，脑心通组各时间点脑含水量均有显著减少（P＜0.05）。见图3。

图3 各组不同时间脑组织含水量比较（n=6）

2.4 EB含量 与MCAO组比较，脑心通组各时间点EB含量均有显著降低（P＜0.05）。见图4。

图4 各组不同时间脑组织EB含量比较（n=6）

2.5 TUNEL染色 MCAO组和脑心通组均可见TUNEL阳性细胞。与MCAO组比较，脑心通组各时间点TUNEL阳性细胞数量均有显著减少（P＜0.05）。见图5。

图5 各组MCAO 3 d梗死周边TUNEL染色荧光图及比较

2.6 ASIC1a表达水平 Western bolt法检测结果显示，与假手术组相比，MCAO组ASIC1a表达量显著增高（P＜O.05）。脑心通组的ASIC1a表达量3 d、7 d与MCAO组比显著下降（P＜O.05）。见图6-7。

图6 各组不同时间ASIC1a蛋白Western blot法检测图像

图7 各组不同时间Western blot法检测ASIC1a半定量分析（n=6）

3 讨论

步长脑心通是由黄芪、川芎、全蝎、地龙、水蛭等十六味中药根据中医补阳还五汤理论研制而成的复方制剂，具有益血活血、化瘀通络之功效，可以有效减少心脑缺血损伤[8]。本实验结果显示步长脑心通可改善脑缺血大鼠神经功能，减少梗死体积，减轻脑水肿，保护血脑屏障完整性，减少梗死周边凋亡细胞数量等作用，与以往研究结果一致。既往关于脑心通保护脑缺血的机制的研究包括，影响一氧化氮合酶[9]、血管内皮生长因子[10]表达，抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-1β[11]、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，mMP）MMP-2、MMP-9[12]、凋亡效应子Caspase-3[13]的表达，从而发挥抵抗血小板聚集，保护神经元，营养保护血管内皮细胞，减轻缺血区周围炎症反应，减轻血管周围的渗出和水肿的作用。而本实验首次探讨步长脑心通是否通过对ASIC1a的影响发挥作用。

发生脑缺血时，脑组织供氧不足导致糖酵解增加。严重情况下，其产物的积聚使局部缺血脑组织周围的pH值快速下降至6.10，从而充分激活ASIC1a通道。Li等[14]在皮层培养物细胞上利用膜片钳技术证明局部缺血通常会激活ASIC电流。脑内ASIC1a高水平表达，介导Ca2+内流[15]，产生的酸性代谢产物和Ca2+超载破坏脑神经元蛋白质、脂类及核酸，进一步导致细胞损伤和死亡[16]。研究证实，脑室内注射ASIC1a阻断剂或剔除ASIC1a基因能抑制酸诱导的脑损伤，脑梗死体积显著减少[17]。上述实验均表明，ASIC1a可能参与了脑缺血后损伤作用。本实验检测到，脑缺血1 d后，ASIC1a的表达即开始上升，并在3 d达到高峰，说明损伤可诱导ASIC1a表达。而脑心通不影响MCAO 1 d后ASIC1a的表达，在3 d、7 d可显著抑制ASIC1a表达。故推测，下调ASIC1a表达可能参与了步长脑心通对亚急性期、而非急性期脑缺血的保护作用。Gao等[18]实验发现，在脑缺血过程中谷氨酸受体和ASIC1a发挥协同作用。另有研究显示钙调素依赖性蛋白激酶II依赖性ASIC1a的磷酸化在诱导神经元死亡中起主要作用[19]。而步长脑心通是否通过以上等方面作用于ASIC1a尚有待进一步研究。

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