重组质粒在洋葱表皮细胞的转化

赵军锋，高英杰，刘玉良，曹 颖



重组质粒在洋葱表皮细胞的转化

赵军锋，高英杰，刘玉良，曹 颖

(河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024)

采用基因枪法，将SCaM4-Citrine、PepA-mRFP和ECBP21-mRFP 3种融合蛋白基因转化到洋葱内表皮细胞．同时，将SCaM4-Citrine、PepA-mRFP基因以及SCaM4-Citrine、ECBP21-mRFP基因分别等量混合，共转化入洋葱内表皮细胞，23℃光照培养18~ 22h，利用激光共聚焦显微镜可观察到大量融合蛋白的表达，基因枪转化技术获得成功．并发现，对于洋葱表皮细胞来说，幼嫩部分的细胞转化率比老的高，并且枪击压力为7 580 kPa或9 300 kPa时为最适压力．

洋葱；基因枪；转化；重组质粒；激光共聚焦显微镜

植物的基因转化是有目的地将外源基因或DNA导入植物，使之整合、表达并遗传．基因转化通常有以下几种途径：以农杆菌介导的基因转化系统，它依赖于Ti质粒作为载体，但其具有狭隘的寄主范围限制；利用原生质体为受体，用PEG、电击、脂质体或显微注射直接将外源基因导入植物原生质体，然而植物原生质体再生难度大，周期长；用花粉管通道将外源DNA导入胚囊，转化受精卵或其前后的细胞，但这种方法效率低、重复性差；基因枪转化系统．其基本原理是将外源DNA包被在微小的金属颗粒(如金、钨等)表面，利用火药爆炸，高压放电或高压气体作为驱动力，使金属颗粒高速射入细胞或组织，从而将颗粒上的外源DNA带入细胞，其中部分DNA整合到细胞染色体上得以表达，完成基因的转化过程．这种方法既可以用于瞬时表达，也可以用于恒定表达．与上述几种方法相比，基因枪转化技术具有以下几个优点：克服了农杆菌介导转化的寄主限制；克服了化学转化只能使用原生质体作为受体的弱点；可以使用两个或两个以上的质粒进行共转化，减少了质粒的构建过程，提高了工作效率；可控度高；操作简便快捷，甚至可克服无菌的困难；转化操作对外源DNA载体没有影响且经微弹穿透后的细胞依然保持存活；转化周期短等．但同时基因枪技术也存在一些不足：整合入植物细胞基因组中的外源基因通常是多拷贝的，这有可能导致植物本身的某些基因非正常表达，还有可能发生共抑制现象(co-suppression)．

基因枪技术从出现到现在的普遍使用仅用了十几年的时间：Klein等首次应用基因枪法将烟草花叶病毒RNA和cat基因分别导入洋葱细胞，他们还将gus基因导入玉米原生质体，得到瞬时表达．Christou用吸附DNA的金粒轰击大豆愈伤组织，获得转化体．1988年，McCab等用外源DNA包被的钨粒对大豆茎尖分生组织进行轰击，获得了再生植株，并在R、R代植株中检测到了外源基因的表达，这些成功的试验大大加快了基因枪技术的应用和发展，使其成为目前实验室作基因转化的常用技术，并且基因枪技术有着广阔的应用前景：如在植物基因转化、外源基因导入植物细胞的细胞器、种质转化、植物基因表达调控研究、微生物的基因导入、动物细胞和组织的转化以及基因治疗中的应用．

本实验室采用PDS-1000/He型基因枪，也曾用基因枪技术做了许多的工作．该实验利用基因枪技术，将一种或两种融合蛋白基因转入洋葱表皮细胞，建立了以洋葱表皮细胞为受体的一系列参数，并为后续实验中研究蛋白质在细胞中的定位及研究蛋白质间的相互作用等奠定了基础．

1 材料与方法

1.1 材料

PUC-35S-SCaM4-Citrine质粒、PUC-35S-ECBP21-mRFP质粒与PUC-35S-PepA-mRFP质粒均为本室构建；洋葱表皮细胞，洋葱购于市场，撕取洋葱内表皮使用．

1.2 方法

1.2.1 处理载体

取直径1 μm的金粉30 mg，加1 mL 70 %乙醇，振荡3 ~ 5 min，静止15 min，离心5 s，去上清．加1 mL无菌水，振荡1 min，静止1 min，短暂离心，去上清，重复用无菌水洗3次．加500 μL甘油，振荡后－20 ℃保存待用．

1.2.2 提取质粒

挑单菌落，置于具有氨苄抗性的LB培养液中，30 ℃摇培过夜；

将细菌培养液倒入2 mL EP管中，12 000 g，1 min离心，收集菌体；

弃上清，在细菌沉淀中加入250 μL P1液，振荡至彻底悬浮；

加入250 μL P2液，立即温和颠倒离心管5 ~ 10次以混匀，室温静止4 min(如果是同时抽提多个样品，加入一管，混匀一管)；

加入350 μL P3液，立即温和颠倒离心管5 ~ 10次以混匀(如果是同时抽提多个样品，加入一管，混匀一管)；12 000 ~ 13 000 g离心10 min．

将上清液小心移入吸附柱，离心15 s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中，也可离心 5 min后，将上清倒入另一个离心管中，再离心2 ~ 3 min后，将上清移入吸附柱以减少蛋白质污染；

在吸附柱中加500 μL B1液，离心15 s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；在吸附柱中加500 μL W1液，离心15 s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中(如果室温低于20℃，离心前先静止1 min)；

在吸附柱中加500 μL W1液，静置1 min后，离心15 s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；离心1 min；

将吸附柱放入一个干净的1.5 mL离心管中，在吸附膜中央加入30 μL T1液，室温静置4 ~ 5 min后，离心1 min．将1.5 mL离心管(DNA溶液)置于4 ℃，待用(如果室温低于20 ℃，室温静置时间延长至5 min，或者在37 ℃水浴静置2 min)．

1.2.3 电泳定量

琼脂糖凝胶电泳是研究细菌和噬菌体DNA的一种适用技术，本实验采用1.0 %琼脂糖进行电泳．电泳用啡啶溴红(溴化乙锭，简写EB)染色，染色后经紫外线照射，DNA样品处具有荧光带，据荧光亮度定性判断质粒DNA量的大小．

1.2.4 准备受体细胞

MS培养基(MS液体+30 g/L蔗糖+0.6 %琼脂，pH值5.8 ~ 5.9，200 mL/12个平皿)垫上灭菌滤纸，材料平铺于培养基中心直径3 cm的范围内，铺平无气泡．撕取洋葱内表皮，光面朝下平铺于滤纸上．

1.2.5 载体包被金粉(2枪用量)

充分振荡保存于50 %甘油的金粉约5 min，取20 μL金粉于1.5 mL EP管中，加16 μL (15 μg DNA)，充分振荡，加28 μL 2.5 M CaCl，弹匀，加亚精胺液(取1 g/mL亚精胺母液15 μL溶于985 μL水中得到0.1 M， －20 ℃保存)12 μL，冰水中静置10 min，12 000 g离心2 s，去上清．加1 mL 70 %乙醇(无菌水配制)充分振荡，12 000 g离心2 s，去上清，加24 μL无水乙醇，充分振荡，待用．(每枪10 μL)

1.2.6 基因枪转化

灭菌培养皿：一个用来配制70 %乙醇(无菌水配制)；一个放70 %异丙醇(无菌水配制)，将可裂膜放入浸一下，立即取出，放灭菌滤纸上吸干；一个放灭菌滤纸．

将DNA载片嵌入固定环中高压灭菌，然后放置在一个大培养皿中，在培养皿外做好标记，将每一个DNA样各取10 μL枪头，直接涂于DNA载片中心(中央圆孔中)，干燥1 min左右．以后操作均按下述步骤进行：打开氮气瓶，调压力表至13 790 kPa；开稳压器；开真空泵开关；取已灭菌的阻挡网，放入托盘中央，取DNA载片倒扣于托盘上，将盖子旋紧，孔朝外放第一层；取7 580 kPa或9 300 kPa可裂膜，在70 %异丙醇中蘸一下，灭菌滤纸上吸干，安装于托座上，用镊子将四周压实，顺时针拧到气体加速器上，旋紧；将盛有洋葱内表皮的培养皿放在托架上，尽量使材料处于圆孔中央，去掉培养皿盖子，放入枪膛第三层．(如果是7 580 kPa的可裂膜可在装材料的培养皿下垫上培养皿盖子以缩短材料到阻挡网之间的距离)；关好枪膛门；抽气至26 ~ 28英寸汞柱时，迅速按下Hold键，接着按发射键并保持不动直到激发为止，松手，放气至压力表为0．开枪膛门，取出培养皿，盖上盖子，标号．重复上述步骤．

1.2.7 转化后的处理

光照培养箱23 ℃培养18 ~ 22 h，利用激光共聚焦显微镜观察表达情况．

1.2.8 利用confocal观察，其参数设定如下：

SCaM4-Citrine单转：激发波长488 nm /发射波长500 ~ 540 nm；

ECBP21-mRFP单转：激发波长543 nm /发射波长600 ~ 640 nm；

PepA-mRFP单转：激发波长543 nm /发射波长600 ~ 640 nm．

SCaM4-Citrine与ECBP21-mRFP共转化需要分别做2次激发以验证2种质粒的共转化：

检验SCaM4-Citrine基因的表达：激发波长488 nm /发射波长500 ~ 540 nm；

检验ECBP21-mRFP基因的表达：激发波长543 nm /发射波长600 ~ 640 nm．

SCaM4-Citrine与PepA-mRFP共转化需要分别做2次激发以验证2种质粒的共转化：

检验SCaM4-Citrine基因的表达：激发波长488 nm /发射波长500 ~5 40 nm．

检验PepA-mRFP基因的表达：激发波长543 nm /发射波长600 ~ 640 nm．

2 结果与分析

由以下几幅图可以看出，由结构基因及荧光蛋白基因构成的融合蛋白基因在洋葱表皮细胞得到良好的表达．其中，无论单转还是共转化，转入SCaM4-Citrine基因的细胞在488 nm激发时可观察到绿色荧光；而转入ECBP21-mRFP基因或PepA-mRFP基因的细胞在543 nm激发时可观察到红色荧光．基因枪转化技术是将重组质粒转入受体细胞进行转化的一种实用技术，它可以实现质粒的单转及两种质粒的共转化．荧光蛋白作为一种标识蛋白，可以通过其强弱判断融合蛋白表达量的大小，同时，荧光蛋白的定位及一些物理性质也可表明结构蛋白的定位及其物理性质．如可对细胞作质壁分离，通过观察质壁分离时荧光蛋白的分布来定位结构蛋白的分布；另外，可通过共转化细胞中两种荧光蛋白发生FRET来研究其标识的2种结构蛋白间的相互作用．

从荧光的分布及强弱我们可以看到，3种融合蛋白在洋葱表皮细胞中表达量都比较高，我们可以清晰地看到细胞的轮廓及细胞核的位置，说明融合蛋白的表达主要分布在细胞膜及细胞核部位．并且SCaM4-Citrine基因及PepA-mRFP基因的表达量较ECBP21-mRFP基因的表达量高．

转化过程中洋葱表皮细胞幼嫩部分转化率较老的高；枪击压力为7 580 kPa或9 300 kPa为宜；受体材料放入枪膛第三层为宜(若为7 580 kPa的可裂膜可在培养皿下垫上盖子)；真空度为26 ~ 28英寸汞柱即可．

图1 SCaM4-Citrine单转

图2 ECBP21-mRFP单转

图3 PepA-mRFP单转

图4 SCaM4-Citrine与ECBP21-mRFP共转化

图5 SCaM4-Citrine与PepA-mRFP共转化

3 讨论

影响基因枪转化率的因素及应注意的事项如下：

1) 包被外源DNA的微弹制备完后，应立即进行轰击处理．

2) 亚精胺最好是现配现用，也可配好后于－20 ℃保存．但不超过30 d，保存时间过长或没有保存好的亚精胺都会发生降解，从而严重影响转化率．

3) 质粒DNA的纯度和浓度是影响转化的重要参数之一．PDS-1000/He型基因枪一般使用0.5 ~ 0.75μg/枪．质粒DNA过多会导致微粒子弹严重结块，过少则会导致被轰击的细胞获得外源DNA的机会减少，二者均影响转化率．

4) 金属微弹的特性及DNA的包裹技术．选用的金属应该是化学惰性的，不宜于DNA或其它细胞成分发生有害反应，常用有金、钨等金属．金属颗粒的形状、大小及分散性等也影响DNA的结合状态和颗粒的穿透能力．

5) 基因枪的物理参数，如轰击一次所用金属微弹的量、金属微弹的速度、样品室的真空度和洋葱表皮细胞到阻挡网之间的距离等，都要通过预备实验来确定其具体参数，以提高转化效率．其中，微弹速度是影响转化率的重要因素，它直接决定了微弹对细胞作用及产生损失的程度．

6) 培养基．如果生长在高渗培养基中可提高转染效率．可使用山梨醇与/或甘露醇，其浓度在0.05 ~ 1.5 mol/L．

7) 基因构建中的选择标记也可影响转化效率．

[1] 马利加P,克莱森D F,卡什莫尔A R,等.植物分子生物学实验指南[M].北京:科学出版社,2000:29-32.

[2] Paul C, Dennis E. McCabe, et al.Stable Transformation of Soybean Callus by DNA-Coated Gold Particles[J].Plant Physiol,1988, 87(3): 671-674.

[3] McCabe D E, Swain W F, Martinell B L, et al. Stable Transformation of Soybean by Particle Acceleration[J].Bio/Technol,1988, 6:923-926.

Recombinant Plasmid Transform into the Cuticle of Onion by Gene Gun Method

ZHAO Jun-feng, GAO Ying-jie, LIU Yu-liang, CAO Ying

(College of Life Science, Hebei Normal University, Shijiazhuang, Hebei 050024, China)

Gene gun method is successfully used to transform three syncretic protein genes named SCaM4-Citrine gene, PepA-mRFP gene and ECBP21-mRFP gene into the cuticle of onion. Synchronously, the same proportion taking from the SCaM4-Citrine gene and PepA-mRFP gene as well as the SCaM4-Citrine gene and ECBP21-mRFP gene are transformed into the cuticle of onion, then cultivated for 18-22 hours at 23 ℃. Then large quantities of syncretic proteins can be seen with confocal microscope. The results suggest that the gene gun method can be successfully used. Besides, in our experiments, we find that for onion, young tender cells have higher transformation rate than the older ones, and the most suitable pressure for gun attack is 7 580 kPa or 9 300 kPa.

onion; gene gun method; transform; recombinant plasmid; confocal microscope

(责任编校：李建明 英文校对：李玉玲)

Q-31

A

1673-2065(2013)01-0031-04

2012-12-09

赵军锋(1974-),男,河北赵县人,河北师范大学生命科学学院实验师;高英杰(1978-),男,河北饶阳人,河北师范大学生命科学学院实验师.