原儿茶醛对大鼠心肌缺血／再灌注损伤的保护作用研究

袁晓峰 王 军 周 丹 中国人民解放军沈阳军区赤峰医院药剂科（赤峰024000）

缺血性心脏病已成为危害人类健康的第一杀手。随着冠状动脉内溶栓和冠脉搭桥等内外科治疗手段的广泛应用，继之出现的心肌缺血／再灌注（myocardia1ischemia／rePerfusion，MI／R）损伤日益受到心脏病学家的高度重视。研究表明，氧化应激［1，2］在MI／R 损伤中发挥着重要的作用。中药治疗MI／R损伤疗效确切、前景良好。许多从中药中分离得到的化合物都具有抗MI／R 损伤的作用，其中对于丹参心肌保护作用的研究最为引人关注。

丹参为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根茎。近年来，临床观察和动物实验都证明丹参具有广泛而复杂的药理活性［3，4］。原儿茶醛是丹参中结构最简单的主要成分，具有邻二酚的母核结构，该药效基团是其显著抗氧化活性的物质基础［5］。因此，我们推测该药物具有保护MI／R 损伤的作用。本实验旨在研究原儿茶醛对大鼠MI／R 损伤的保护作用。

1 材料 1.1动物 SD 雄性大鼠，250±20g，由第四军医大学实验动物中心提供。实验期间提供足量的自来水及实验动物中心提供的普通饲料，动物室保持22℃，自然通风，相对湿度60%～70%，光照周期8：00～20：00。适应7d后用于实验。

1.2 药物与试剂 原儿茶醛购自贵州迪达科技有限公司；肌酸激酶同工酶（creatine kinase－MB，CK－MB），肌钙蛋白（cardiac troPonin，cTnI）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）等试剂盒由上海西唐生物技术公司提供；2，3，5－氯化三苯基四氮唑蓝（Tetrazolium chloride，TTC）染色剂由中国医药集团上海化学试剂公司提供；伊文思蓝（Evans Blue，EB）由美国Sigma－Aldrich公司提供。

1.3 主要仪器 HX－100E小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）；TDZ4A－WS低速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；COOLPIX S1 型照相机（Nikon公司，日本）；5417型低温高速离心机（EPPendorf公司）。

2 方法 2.1 大鼠MI／R 模型制备 大鼠称重后，2 mL／kg腹腔注射3%戊巴比妥钠，仰卧位固定，连接心电图监测，气管插管并接呼吸机（频率：75次／min；潮气量：8～9 mL；吸：呼＝1：2），胸骨左缘旁纵行切开第3～5肋间做横行切口，剪开并挑起心包，暴露心脏，以左心耳与肺动脉圆锥交界处的左冠状动脉前降支（Left anterior descending coronary aery，LAD）为标志，于左心耳下方1～2mm 处进针、穿线（横跨左冠状动脉前降支），将一小硅胶管从丝线两端穿入，稳定10 min后结扎，缺血30 min后，再灌注3h 结束。成功标准［7］：结扎LAD 后心电图II导联ST 段出现弓背向上抬高，T 波高耸等为缺血成功；放松结扎线后，抬高的ST 段下降1／2以上为再灌注成功。假手术组动物只穿线，不结扎，其余两组均进行30 min缺血和3h再灌注。

2.2 实验动物分组 将大鼠随机分为3组，假手术组，模型组，原儿茶醛组（5，10，20 mg／kg）。假手术组穿线，但不结扎；模型组颈静脉注射生理盐水，给药组给予颈静脉注射原儿茶醛水溶液。给药时间为再灌注即刻。

2.3 心肌梗死面积测定［6］再灌注3h后，再次结扎各组大鼠左冠状动脉前降支，从颈动脉迅速注入3% EB 溶液2 mL，待大鼠口唇及四肢末梢皮肤蓝染后迅速摘除心脏，滤纸吸除心室腔中残余染液，－80℃冻存。取出后自心尖向心底平行房室沟方向将其切成相等厚度的5片，2%TTC溶液（PH＝7.4）37℃孵育10min，4%多聚甲醛固定过夜。染色后白色代表梗塞区（area of necrosis，AN），红色代表缺血但未梗塞区，蓝色代表正常区，危险区（area at risk，AAR）为红色和白色面积之和［7，8］。采用Image－Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析。梗塞程度采用梗塞区面积（AN）与危险区面积（AAR）的比值表示。

2.4 血清生化指标测定 再灌注3h后，腹主动脉取血，分离血清，离心（4000r／min）12 min，试剂盒检测CK－MB，cTnI和LDH 的活性。

2.5 统计学分析 实验数据均表示为，使用ANOVA 进行多组均数之间差别的统计学检验，两两比较采用LSD 法。采用SPSS16.0进行统计分析。以P＜0.05为差别有统计学意义。

3 结 果 3.1 原儿茶醛对MI／R 损伤大鼠心肌梗塞面积的影响 模型组心肌梗塞面积严重，给予原儿茶醛后，给药组梗塞面积有所下降。原儿茶醛（10）及原儿茶醛（20）两个剂量组与模型组比较，梗塞面积均降低（P ＜0.05）。详见图1，表1。

图1 原儿茶醛对大鼠MI／R 损伤心肌梗塞面积的影响

表1 原儿茶醛对大鼠MI／R 损伤心肌梗塞面积的影响（±s，n＝6）

表1 原儿茶醛对大鼠MI／R 损伤心肌梗塞面积的影响（±s，n＝6）

注：△P ＜0.05 vs 模型组。

组别模型组原儿茶醛（5）原儿茶醛（10）原儿茶醛（20梗塞面积（%）41.28±6.15 30.34±5.86 27.67±5.51△24.34±3.25△

3.2 原儿茶醛对大鼠MI／R 损伤血清中CK－MB，cTnI和LDH 的影响 与假手术比较，模型组血清CK－MB，cTnI和LDH 水平显著升高（P ＜0.05）；原儿茶醛（20）组与模型组比较，血清CK－MB，cTnI和LDH 水平均显著下降（P ＜0.05），详见表2。

表2 原儿茶醛对大鼠MI／R 损伤血清CK－MB，cTnI和LDH 的影响（±s，n＝6）

表2 原儿茶醛对大鼠MI／R 损伤血清CK－MB，cTnI和LDH 的影响（±s，n＝6）

注：△P ＜0.05 vs 假手术组；▲P ＜0.05 vs 模型组。

组别CK－MB（ng／mL） cTnI（ng／mL）LDH（U／L）假手术组37.19±15.06 2.95±0.83 18450.50±524.16模型组92.03±12.38■ 12.39±2.30■51981.02±1341.67原儿茶醛（5）83.81±12.44 10.35±1.06 49419.67±764.63原儿茶醛（10）76.33±9.75 44.20±17.07▲33921.12±872.96▲原儿茶醛（20） 10.02±1.42▲7.38±1.20▲ 20872.29±717.21▲△

4 讨 论 研究普遍认为心肌缺血期间的损伤为再灌注损伤的发生奠定了基础，再灌注损伤是缺血损伤的延续、扩大和恶化［9］。随着心脏血流的重建，左心室功能得到改善，这部分心肌将得以保全。如能合理使用抗再灌注损伤药物，将大大减少再灌注损伤带来的危害［10］。

随着氧自由基（OFR）在疾病中的研究日趋深入，大量资料证实氧自由基与MI／R 损伤的发生、发展有着密切关系。较为一致的观点认为，由于种种致病因子的作用，导致OFR 蓄集，OFR 使细胞膜上的脂质产生过氧化而生成过氧化脂质（LPO），LPO 进一步损伤心肌细胞膜系统的结构及功能，而导致细胞死亡［11－14］。大量研究表明原儿茶醛具有较好的清除氧自由基的活性［5］。本研究观察了原儿茶醛治疗MI／R 损伤的保护作用，为其开发成临床用药奠定了理论基础。

梗塞面积被认为是衡量MI／R 损伤的金标准，而心肌保护正是以缩小梗塞面积为前提的，临床上心肌梗塞面积的大小直接关系到患者的预后［15］。通过测量大鼠心脏梗塞面积，我们发现原儿茶醛能够显著降低心肌梗塞面积，提示原儿茶醛对再灌注时的心肌具有良好的保护作用。此外，心肌损伤特异性的酶也是临床诊断心肌缺血／再灌注损伤的指标。其中CK－MB，cTnI和LDH 为细胞内重要的能量代谢酶，是急性心肌损伤的血清标志物［16］。MI／R 损伤大鼠血清中的CK－MB，cTnI和LDH 含量均明显升高；而原儿茶醛能够降低大鼠血清中的CK－MB，cTnI和LDH 水平。通过以上药效学指标，我们证实原儿茶醛在MI／R 损伤中具有良好的心肌保护作用。

［1］ Peterson DA，Asinger RW，ElsPerger KJ，Homans DC，Eaton JW.Reactive oxygen sPecies may cause myocardial rePerfusion injury.Biochem BioPhys Res Commun［J］.1985，127（1）：87－93.

［2］ Venardos KM，Perkins A，Headrick J，Kaye DM.Myocardial ischemia－rePerfusion injury，antioxidant enzyme systems，and selenium：a review［J］.Curr Med Chem，2007，14（14）：1539－1549.

［3］ Zhou L，Zuo Z，Chow MS，et a1.Danshen：an overview of its chemistry，Pharmacology，Pharmacokinetics，and clinical use［J］.J Clin Pharmacol，2005，45（12）：1345－1359.

［4］ 付辛芳，刘晓红.丹参的药理作用与临床应用研究进展［J］.中国药业，2006，15（1）：76－77.

［5］ 刘 梅，夏鑫华，张志敏，等.丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和丹酚酸B体外抗氧化活性比较研究［J］.中药材，2009，32（2）：265－267.

［6］ Hangaishi M，Nakajima H，Taguchi J，et a1.Lecithinized Cu，Zn－suPeroxide dismutase limits the infarct size following ischemia－rePerfusion injury in rat hearts in vivo［J］.Biochem BioPhy Res Commun，2001，285（5）：l220－1228.

［7］ Sodha NR，Clements RT，Feng J，et a1.The effects of theraPeutic sulfide on myocardial aPoPtosis in resPonse to ischemia－rePerfusion injury［J］.Eur J Cardiothorac Surg，2008，33（5）：906－913.

［8］ OsiPov RM，Bianchi C，Fcng J，et a1.Effect of hy－Percholesterolenfia on myocardial necrosis and aPoPtosis in the setting of ischemia－rePerfusion［J］.Circulation，2009，120SuPPl l1：S22－S30.

［9］ 石燕燕；李树青.心肌缺血再灌注损伤治疗进展［J］.中国心血管病研究杂志，2007，5（10）：777－779.

［10］ 田 涛，马 宾.药物后处理对减轻心肌缺血再灌注损伤的研究进展［J］.中华老年心脑血病杂志，2011，13（2）：181－183.

［11］ Lin Y H，Liu A H，Wu H L，et a1.Salvianolic acid B，an antioxidant from Salvia mihiorrhiza，Prevents Aβ25－35－induced reduction in BPRP in PC12cells［J］.Biochemical and Bio－Physical Research Communications，2006，348（2）：593－599.

［12］ Yue K K.M.，Lee K W，Chan K K C，et a1.Dansh－en Prevents the occurrence of oxidative stress in the eye and aorta of diabetic rats without affecting the hyPerglycemic state［J］.EthnoPharma，2006，106（1）：136－141.

［13］ Zhao G R，Xiang Z J，Ye T X，et a1.Antioxidant activities of Salvia miltiorrhiza and Panax notoginseng［J］.Food Chemistry，2006（4）：767－774.

［14］ Xia Z Y，Gu J Z，Ansley D M，et a1.Antioxidant theraPy with Salvia miltiorrhiza decreases Plasma endothelin－1 and thromboxane B2after cardioPulmonary byPass in Patients with congenital heart disease［J］.J Thoracic and Cardiovascular Surgery，2003，126（5）：1404－1410.

［15］ Friedrich，M.G.，Abdel－Aty，H.，Taylor，A.，Schulz－Menger，J.，Messroghli，D.and Dietz，R.，.The salvaged area at risk in rePerfused acute myocardial infarction as visualized by cardiovascular magnetic resonance［J］.J.Am.Coll.Cardiol，2008，51，1581－1587.

［16］ Gurgun C，Ildizli M，Yavuzgil O，Sin A，APaydin A，Cinar C and Kultursay H，.The effects of short term statin treatment on left ventricular function and inflammatory markers in Patients with chronic heart failure［J］.Int.J.Cardiol，2008，123：102－107.