七种中药提取物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌试验

李思聪，曾富强，聂 健，王 斌，李金良，李旭廷

（四川省畜牧科学研究院兽药研究所，四川 成都 610066）

在我国养殖业中，抗生素一直是防治畜禽细菌性感染疾病的首选，抗生素的长期使用虽然在防治细菌性疾病中起了重要作用，但是所带来的药物残留及耐药性等危害已日趋严重，给当今规模化安全养殖和人类健康带来了严重威胁。中药属于纯天然药物，其毒性低，不会造成严重的药物残留，不易产生耐药性；同时研究发现利用中草药及其提取物可以发挥直接杀灭病原菌或通过提高机体免疫力达到防治疾病的效果，这为我国传统中药替代抗生素防治细菌性疾病奠定了良好的基础。本试验选用连翘等7味中药，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的标准株和临床分离耐药株进行了体外抑菌作用研究，旨在筛选出对临床耐药菌株有抑菌作用的药物，为指导中药在临床上的正确使用，逆转临床耐药菌株的耐药性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药 赤芍、白术、穿心莲、莪术、秦艽、连翘、知母，购自成都市德仁堂中药店，经四川某动物药业有限责任公司中药检验室的显微镜检和薄层色谱鉴定，表明均为合格品。

1.1.2 试验菌株 标准菌株：金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922；临床分离菌株：耐药金黄色葡萄球菌LQ1007SA-5（分离自成都地区奶牛乳房炎病例），耐药大肠埃希菌AY1106EC-2（分离自安岳县仔猪临床腹泻病例），于四川省畜牧科学研究院兽药研究所保存。

1.1.3 仪器与试剂 旋转蒸发器RE-52（上海亚荣生化仪器厂生产），高压灭菌釜MLS-3750（产自日本三洋公司），净化工作台（成都红光空调净化设备制造公司生产），隔水式恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂生产），游标卡尺，微量移液器（芬兰Finnpipette公司生产），玻璃涂布棒；N-甲基吡咯烷酮（NMP），营养肉汤培养基、营养肉汤（杭州天和微生物试剂有限公司生产），庆大霉素药敏纸片（10μg/片）、青霉素 G 药敏纸片（10μg/片），均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 药液的制备 取粉碎后的中草药100g于1000mL 65%乙醇水溶液中，室温浸泡30min后煎煮1h，稍加冷却后过滤得到初煎液；在剩余药渣中加入800mL 65%乙醇，煮沸1h，合并两次煎液，减压蒸馏浓缩至100mL，即制得提取物。提取物经10000r/min离心5min，取上清液灌装于5mL抗生素专用玻璃瓶中，即得1g/mL中药上清液；于沉淀中加入等量NMP溶解，就可制成1g/mL中药沉淀溶液，然后灌装于5mL抗生素专用玻璃瓶中。将上清液和沉淀溶液分别在121℃下灭菌25min，于4℃冰箱内保存备用。

1.2.2 菌液的制备 将大肠埃希菌ATCC25922等2株标准株和大肠埃希菌AY1106EC-2等2株临床分离株在营养肉汤培养基上划线培养后，又挑取单菌落接种于营养肉汤中培养12～16h，作为原菌液。

1.2.3 营养琼脂培养基的制备 将灭菌后的营养琼脂倾注至无菌干燥平皿上（约20mL），待培养基冷却后将其置于37℃恒温培养箱中进行24h无菌检测，用密封口袋封装于4℃冰箱中备用，7d内用完。

1.2.4 抑菌试验 采用管碟法。用微量移液器吸取浓度为0.5麦氏单位的细菌稀释液（1.5×108cfu/mL）100 μ至营养琼脂培养基表面，立即用无菌玻璃涂布棒均匀涂布，然后用无菌镊子将钢管均匀摆放在平板上，静置10～15min，滴加受试药液至液面与钢管表面平行。将平板置于37℃下培养12～18h后，采用“十字交叉法”测定抑菌圈大小。

1.2.5 抑菌圈结果判定标准 参照《中药药理学》抑菌圈结果判定标准：抑菌圈直径≥20mm为高度敏感，10 19mm为中度敏感，＜10mm为不敏感。

2 结果

2.1 7种中药提取物对大肠埃希菌的抑菌效果 由表1可知，在大肠埃希菌标准株的抑菌试验中，7味中药提取物沉淀部分的抑菌效果与庆大霉素相当，抑菌圈直径在19.86～22.84mm之间。在大肠埃希菌临床株的抑菌试验中，连翘、赤芍、白术、知母沉淀部分的抑菌效果优于庆大霉素，抑菌圈直径在18.58～22.28mm之间。总体上看，受试7味中药沉淀部分的抑菌效果较好，且均优于各自上清液的抑菌效果。

表1 中药提取物对大肠埃希菌的抑菌效果mm

2.2 7种中药提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 由表2可知，在金黄色葡萄球菌标准株的抑菌试验中，味中药提取物的抑菌效果不如青霉素。在金黄色葡萄球菌临床耐药株的抑菌试验中，连翘、赤芍提取物的抑菌效果优于青霉素，抑菌圈直径在24.94～26.60mm之间总体上看，7味中药提取物对临床耐药金葡菌的抑菌效果要好于标准金葡菌，且沉淀部分的抑菌效果要优于各自的上清液。

表2 中药提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果 mm

3 讨论

3.1 不同提取条件对抗菌效果的影响 不同提取条件对中药抗菌成分提取率的影响非常广泛。应用于中药提取物生产的溶剂主要有水、乙醇及两者的混合物，但中药抗菌成分复杂，无论选用水提醇沉法还是醇提水沉法均会产生大量沉淀，被当成无用物质除去。本项研究选择水醇混合溶剂进行煎煮提取，最大限度地促进中药有效成分的溶出提取，在蒸发浓缩阶段除收取上清液外，对浓缩过程产生的沉淀用无抗菌活性的N-甲基吡咯烷酮进行复溶，同时测定上清液和沉淀物的抗菌效果。试验结果表明，多数受试中药提取后沉淀物的抗菌效果优于上清液，可以推测出抗菌活性物质应多为极性小的醇溶性物质，这为进一步开展相关活性成分的分离鉴定起到了指示作用。

3.2 中药提取物对耐药菌株和标准菌株的抑菌效果 受试的临床大肠埃希菌（AY1106EC-2）分离自四川仔猪腹泻病例，与标准大肠埃希菌株相比，前者降低了对庆大霉素的敏感性。但在本次试验中我们发现，连翘、赤芍白术、知母沉淀部分的抑菌效果优于庆大霉素，并且与标准菌株相比，中药对临床菌的抑菌圈更大，显示出中药提取物的抑菌机制不受耐药菌通常的耐药机制影响受试的临床耐药金黄色葡萄球菌（LQ1007SA-5）分离自成都周边奶牛场奶牛乳房炎病例，在前期耐药性测试中表现出明显的多重耐药性，耐药基因检测发现其含有mecA基因，该基因负责编码的青霉素结合蛋白2α能降低青霉素的结合，维持金葡菌细胞壁的正常功能，达到对β-内酰胺类抗生素耐药的效果。在受试的7种中药中，多数表现出较好的抑菌效果，其中赤芍和连翘提取物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果接近甚至优于抗生素。特别是赤芍和连翘提取物的沉淀部分，对临床耐药金葡菌的抑菌效果显著优于青霉素但在标准金葡菌抑菌试验中，效果明显不及青霉素这说明中药对耐药金葡菌的作用机制和作用靶点或许不同于β-内酰胺类抗生素，有可能增加了抗菌活性物质与耐药金葡菌细胞壁靶蛋白的结合能力，进而破坏金葡菌细胞壁的合成，增加其对中药抑菌物质的敏感性，达到提高抑菌效果的目的。其内在作用机制有待进一步研究确认。

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