交叉引物等温扩增技术检测沙门氏菌

祁军，左峰，刘国红，刘红梅，徐高连，张霞，*

（1.天津出入境检验检疫局，天津 300461；2.杭州优思达生物技术有限公司，浙江 杭州 310053）

沙门氏菌是一种食源性病原菌，为肠杆菌科、肠杆菌属的一个种[1]，沙门氏菌属有的专对人类致病，有的只对动物致病，也有对人和动物都致病。沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒[2-4]。据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。

国外学者相继开发出多种沙门氏菌的检测、分离方法。目前国际、国内上对于沙门氏菌的检测方法主要有常规生化检测方法、胶体金测试条法、荧光免疫分析法和PCR 法、实时荧光PCR 法、环介导恒温扩增法等分子生物学方法[5-7]，鉴于国内外对沙门氏菌各种检测技术均有深入研究，本研究应用一种新的交叉引物等温扩增技术[8]建立一种既有分子生物学检测的高灵敏、高通量，又具有免疫学检测的特异性好、操作简捷，又不需要任何复杂仪器的快速检测方法，以适用于基层实验室和现场快速筛查检测。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

dNTPs：Fermentas；10 × Bst buffer：New England Biolabs；Bst DNA polymerase large fragment：New England Biolabs；MgSO4：Sigma；betaine：Sigma；核酸快速检测试纸条：杭州优思达公司。

菌株采用沙门氏菌19 株，包括4 株CMCC 菌株、来自14 个国家样品中分离出的野生株及35 株其他相关阴性菌，详见表1。

表1 试验菌株Table 1 Bacterial strains for detection

续表1 试验菌株Continue table 1 Bacterial strains for detection

1.2 主要仪器与设备

PCR 扩增仪：Biometra；离心机：Eppendorf，5417R；DNA/RNA/蛋白分析仪：BHIMUZDA，Bio Specmini。

1.3 方法

1.3.1 DNA 的提取及定量

沙门氏菌CMCC 50041 为试验菌株，接种于10 mL营养肉汤中，37 ℃培养16 h，取1 mL 用于细菌基因组提取，利用紫外分光光度计检测DNA 质量及纯度。

1.3.2 引物及探针的设计

利用沙门氏菌特有的序列[10-11]设计特异性引物及探 针 为：SALMF31：5 -GCGGAAGTCGCGGCCCG；SALMB3：5-TCGCACCGTCAAAGGAACC；SALMCPR1：5 -AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTC GCCGTTCGC；SALMDF5F：5-FITC-AGGCCGGTATTA TTGATGC；SALMDF5B2：5-BIOTIN-TTTCTCTGGATG GTATGC。

1.3.3 反应体系和反应条件

反应体系为：10×ThermoPol buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，100 mmol/L MgSO40.8 μL，5 mol/L Betaine 2 μL，8 U/μL Bst DNA pol 1 μL，20 μmol/L SALMF31/SALMB3 0.1 μL/0.1 μL，10 μmol/L SALMCPR1 0.8 μL，20 μmol/L SALMDF5F/SALMDF5B2 0.8 μL/0.8 μL，模板1 μL，ddH2O 补足至50 μL。

反应条件：63 ℃反应60 min。

1.3.4 特异性试验

对表1 中菌株核酸样本进行试验，以证明检测方法是否具有通用性及特异性。

1.3.5 灵敏度试验

通过对提取DNA 进行定量、纯菌液计数后10 倍稀释，按照反应体系进行试验，试验重复6 次检测。

1.3.6 实际样品检测

用该研究建立的检测方法体系与现有国家标准检测方法同时对来源于不同国家的不同种类食品的127 份实际样品进行普查检测，确定该检测体系的假阳性率及假阴性率，客观全面分析评估建立的检测体系可操作性及准确率。

2 结果与分析

2.1 特异性试验

检测54 株实验菌株，其中19 株沙门氏菌检测全部为阳性，图1 是部分沙门氏菌检测结果；其余35 株阴性相关菌检测为阴性，图2 为部分肠杆菌科其他阴性菌株的试验结果，说明该方法特异性良好，而且对于沙门氏菌检测具有很好的通用性。

图1 沙门氏菌特异性检测Fig.1 Specificity of detecting salmonella strains

图2 非沙门氏菌特异性检测Fig.2 Specificity of detecting for non-salmonella bacterial strains

2.2 灵敏度试验

2.2.1 DNA 检测灵敏度

利用紫外分光光度计检测CMCC 50041 DNA 纯度为1.982，质量68.44 μg/mL。用TE 对DNA 原液进行10 倍梯度稀释至10-8，按照反应体系进行试验，试验重复6 次，结果见表2，说明该方法DNA 检测灵敏度可达到101fg/反应。

表2 CMCC 50041 DNA 灵敏度试验结果Table 2 Sensitivity of detecting salmonella CMCC 50041 DNA

2.2.2 纯菌液灵敏度检测

沙门氏菌CMCC 50041 过夜菌液计数为6.0×108CFU/mL，用PBS 对菌液进行10 倍梯度稀释至6.0×100CFU/mL，各取1 mL 提取细菌基因组做实验模板，结果见图3，灵敏度达到102CFU/mL。

图3 沙门氏菌CMCC 50041 菌液灵敏度试验Fig.3 Sensitivity of detecting salmonella CMCC 50041 in pure culture

2.3 实际样品检测

对127 份实际样品进行普查检测，金标准的传统生化检测结果阳性样品3 个，阴性结果124 个；该检测方法阳性结果5 个，阴性结果122 个。两种检测方法结果大致相符，新建立的方法没有漏检情况，有可能出现假阳性，但发生率较低。

3 结论

与传统检测手段相比，基因检测能更快，也能更可靠发现食品安全隐患。目前得到广泛应用的分子生物学检测技术有PCR、实时荧光PCR 及环介导恒温扩增法（LAMP），其高度灵敏、高度特异及快速的优点使分子生物学方法得到广泛使用。

本研究建立的交叉引物恒温扩增技术检测沙门氏菌的快速筛选方法，检测DNA 灵敏度可达到101fg/反应、纯菌液灵敏度达到102CFU/mL 可满足样品检测需求。同时通过对大量实际样品检测，同金标准的检测结果大致相符，没有漏检情况，有可能出现假阳性，但发生率较低。实验结果表明，该方法特异性强、灵敏度高，操作简便，不需要特殊设备，特别适合于基层实验室检测以及样品的快速筛选检测。

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