糖尿病肾病大鼠ET-1、IL-1β的表达及多种银杏叶提取物的干预作用比较

马文祥 沈建飞 盛一梁

（苏州太仓市中医医院药剂科，苏州 太仓 215400）

糖尿病肾病大鼠ET-1、IL-1β的表达及多种银杏叶提取物的干预作用比较

马文祥 沈建飞 盛一梁

（苏州太仓市中医医院药剂科，苏州 太仓 215400）

目的 探讨糖尿病肾病大鼠中ET-1、IL-1β细胞因子表达情况，多种银杏叶提取物对其表达的影响。方法 120只健康雄性Wistar大鼠随机分为正常组、假手术组、糖尿病肾病组、舒血宁注射液组、银杏达莫注射液组、金纳多注射液组，建立糖尿病肾病模型，严格按照试剂盒上的操作方法，测定各组大鼠ET-1、IL-1β含量。结果 与正常组比较，糖尿病肾病组血清、尿液、肾脏组织中ET-1和血清IL-1β的含量升高（P＜0.05）；与糖尿病肾病组比较，三种银杏叶提取物注射液均能显著降低ET-1、IL-1β含量（P＜0.05），尤其是金纳多注射液能显著降低尿液、肾脏组织中ET-1和血清IL-1β（P＜0.01）。糖尿病肾病组血清中ET-1、IL-1β均分别呈正相关（r=0.79、0.83，P＜0.05）。结论 糖尿病肾病大鼠ET-1、IL-1β细胞因子的表达明显升高，且二者血清中的表达具有正相关；银杏叶提取物注射液中金纳多注射液干预后，与糖尿病肾病组比较，ET-1、IL-1β细胞因子表达下调最为明显，但各银杏叶提取物组间比较，无显著性差异（P＞0.05）。

糖尿病肾病；ET-1；IL-1β；相关性；舒血宁注射液；银杏达莫注射液；金纳多注射液

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的微血管并发症之一，严重影响糖尿病患者的预后和生存，一旦出现肾小球基底膜（GBM）增厚和以系膜区为主的细胞外基质（ECM）增生等病理变化，往往难于逆转，是糖尿病致残致死的重要原因。发病机制不清楚，认为与细胞因子参与发病有关，ET-1、IL-1β在NS的发病中起重要作用。本实验通过观察不同银杏叶提取物对DN早期ET-1、IL-1β表达的影响，初步探讨银杏叶提取物对DN发生、发展的作用以及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

健康雄性wistar大鼠，体质量200～250g，120只（苏州大学动物饲养中心提供）。链脲佐菌素（STZ）（北京博爱港商贸有限公司）。舒血宁注射液，北京双鹤天然药物有限责任公司，批号：1301030101，5mL/支，折合银杏叶提取物为17.5mg（含总黄酮醇苷4.2mg；银杏内酯0.70mg）。银杏达莫注射液，湖北民康制药有限公司，批号：20130305，5mL/支，含银杏总黄酮4.5～5.5mg、双嘧达莫1.8～2.2mg。金纳多注射液，德国威玛舒培博士大药厂，批号458643-1，5mL/支，折合银杏叶提取物17.5mg，（含银杏黄酮苷4.2mg）。IL-1β放射免疫分析药盒均购自北京北方生物技术研究所。ET-1放射免疫试剂盒（中国人民解放军东亚放免所）。

1.2 DN模型与分组

120只大鼠禁食12h，随机分出，20只为正常对照组。20只为假手术组（n=20，麻醉后从右背部入口分离右肾，并不作任何处理，作关闭切口，常规饲料，生理盐水灌胃），大鼠按体质量，腹腔注射65mg/kg枸橼酸缓冲液（0.1mmol/L）。

其余组别按Wistar大鼠体质量，大鼠腹腔注射氯氨酮70mg/kg麻醉后行右肾切除术1周后，予高糖高脂饮食（常规饲料加20%蔗糖、10%猪油、2.5%胆固醇），4周后（即实验开始后第5周末），链脲佐菌素临用前用0.1mmol/L枸橼酸缓冲液配成1%浓度（pH值=4.0）。给予链脲佐菌素（STZ）65mg/kg左下腹腔一次性注射。72h后取尾血测非空腹血糖，以血糖≥16.7mmol/L者确立为糖尿病大鼠模型，连续监测血糖、尿糖3d，持续血糖＞16.6mmol/L，尿糖定性+++～++++确定为糖尿病形成，建模失败者剔除。

实验大鼠分为正常对照组、假手术组、DN组、舒血宁注射液组、银杏达莫注射液组、金纳多注射液组各20只（n=20，每10只一组，为早、晚期对照）。所有大鼠常规饲养，不限制饮水，不使用胰岛素。

表1 第2周末ET-1与IL-1β含量变化（）

表1 第2周末ET-1与IL-1β含量变化（）

组别n ET-1IL-1β血清(ng/L)尿液(ng/24h)肾脏(ng/g)血清(ng/mL)正常组1070.89±6.711.19±0.17146.06±9.550.07±0.91假手术组1080.13±4.111.32±0.75151.12±6.330.06±0.32 DN组10144.11±8.83*△5.67±0.37*△225.69±7.63*△0.51±0.31*△舒血宁注射液组10112.47±6.38*△◇3.21±0.27*△◇174.02±9.21*◇0.15±0.44◇银杏达莫注射组10125.13±5.83*△◇2.15±0.36*△◇166.74±8.57◇0.17±0.73◇金纳多注射液组10103.69±6.39*◇0.58±0.47◇◇153.75±7.85◇◇0.16±0.99◇◇

表2 第8周末ET-1与IL-1β含量变化（）

表2 第8周末ET-1与IL-1β含量变化（）

组别n ET-1IL-1β血清(ng/L)尿液(ng/24h)肾脏(ng/g)血清(ng/mL)正常组1075.15±6.651.23±0.23143.15±6.840.08±0.25假手术组1085.34±5.731.47±1.51167.93±5.730.07±0.83 DN组10169.33±12.67*△6.95±0.58*△246.52±10.36*△0.65±0.13*△舒血宁注射液组10134.15±10.65*△◇3.78±0.49*△◇187.39±11.72*◇0.11±0.08◇银杏达莫注射组10147.98±11.36*△4.38±1.73*△162.83±15.38◇0.44±0.37*△金纳多注射液组10114.13±8.99*◇2.16±0.58◇◇157.82±12.03◇◇0.11±0.67◇◇

1.3 方法

1.3.1 给药方法

根据糖尿病大鼠饮水量为正常大鼠的2.5倍，舒血宁注射液组、银杏达莫注射液组、金纳多注射液组三组分别于第1天和4周后腹腔注射舒血宁注射液、银杏达莫注射液、金纳多注射液，按体质量称重，剂量为4mg/（kg·d）。其余三组于第1天和4周后分别腹腔注射生理盐水4mg/（kg·d）。

1.3.2 观察指标

第2、8周末，禁食8h后，称重、麻醉，无菌操作，动物麻醉称重，股动脉放血，离心后血清-80℃保存，分离提取血清，ET-1与IL-1β含量按相应的放免试剂盒说明操作；收集各组大鼠24h尿液，离心，去沉淀，-20℃保存，ET-1含量按相应的放免试剂盒说明操作。

大鼠取完血后，断头处死，取肾组织，称取200mg，剪碎，加入0.15mol/L乙酸，水浴煮沸后在冰浴下用电子恒速组织匀浆器研磨匀浆，3000r/min，离心15min，离心后取上清液，-70℃保存ET-1含量按相应的放免试剂盒说明操作。

1.3.3 统计学处理

2 结 果

2.1 第2周末ET-1与IL-1β含量变化，见表1。

与正常组比较*P＜0.05；与假手术组比较△P＜0.05；与DN组比较◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

2.2 第8周末ET-1与IL-1β含量变化，见表2。

与正常组比较*P＜0.05；与假手术组比较△P＜0.05；与DN组比较◇P＜0.05，◇◇P＜0.01

2.3 第2、8周末DN组血清中ET-1与IL-1β的相关性考察

第2周与第8周末，DN组血清中ET-1、IL-1β均呈正相关（r=0.79、0.83，P＜0.05）；随着DA组血清中ET-1含量的增高，IL-1β含量升高。

3 讨 论

有人认为DN是肾脏的微血管病变，早期表现为肾小球高滤过状态，继之出现微量白蛋白尿，尿中白蛋白量逐渐增高进入临床肾病期，最后发展为终末期肾病。其中肾脏血流动力学改变是微血管病变根本因素，加速基底膜增厚。当基底膜增厚严重时，受累的微细血管可部分或全部阻塞，引起组织缺氧，损伤，形成炎症，以致病变持续加重。目前关于ET-1和DN之间关系研究绝大部分限于实验室研究阶段。ET-1是日本学者1988年从猪动脉内皮细胞培养液中分离出来的一种小分子生物活性肽[1]，主要由血管内皮细胞合成释放的血管活性多肽，是目前已知体内作用时间最持久的缩血管物质。ET在肾脏疾病中的作用，除了引起血液动力学紊乱、水盐代谢失调等之外，ET还是一种强大的促纤维化因子，是一种强大的炎症介质。糖尿病患者长期高血糖状态能加速和大量形成晚期糖化终末产物，糖化终末产物能刺激单核-巨噬细胞表达和释放IL-1β。DN时肾小球IL-1β含量的增加与此有关。IL-1β也可刺激肾系膜细胞合成与释放PG。IL-1β促使系膜细胞、成纤维细胞、内皮细胞、细胞外基质增殖，引起肾小球基质膨胀，最终导致肾小球硬化，并产生肾脏的慢性炎症[2]。

第2、8周末模型组中ET-1和IL-1β均高于正常组和假手术组，舒血宁注射液组，银杏达莫注射组均能够显著降低ET-1和IL-1β在模型组中的含量（P＜0.05），但并不能全部降低至正常组水平。金纳多注射液组可以将ET-1和IL-1β的水平降低至正常组水平，二者间无显著性差异（P＞0.05）。同时，随着病情的发展，第8周模型组血清、尿液、肾脏组织中ET-1和血清IL-1β的含量均高于第2周模型组的含量，表明糖尿病肾病发生时，如不及早干预，炎症介质会增加含量，发展严重的可能。第2周末，DN组血清中ET-1、IL-1β均呈正相关（P＜0.05），相关系数r=0.79；第8周末，DN组血清中ET-1、IL-1β均呈正相关（P＜0.05），相关系数r=0.83。说明糖尿病肾病大鼠血清中ET-1和IL-1β存在着相互作用，二者间可能通过发挥糖尿病肾病炎症作用。

笔者认为DN的发病机理比较复杂，是多种因素一起作用的结果。大量实验研究表明，ET-1、IL-1β在DN发病过程中发挥重要的作用。银杏提取物针剂由于其有效成分对糖尿病肾病的药理作用，逐渐引起国内外学者重视。本实验比较不同银杏提取物针剂对糖尿病肾病大鼠的ET-1、IL-1β水平影响，其中，金纳多注射液作用更优，但各银杏叶提取物组间比较，无显著性差异（P＞0.05）。

[1] 顾江萍,赵玲,栗德林.水蛭对糖尿病肾病大鼠内皮素-1水平的影响[J].中成药,2007,29(10):1421-1422.

[2] 戎健,邱鸿鑫.细胞因子、细胞生长因子与糖尿病微血管病变.《国外医学》内分泌学分册,1996,16(3):125-126.

R587.2

B

1671-8194（2013）34-0070-02