可疑产碳青霉烯酶肠杆菌的耐药性及与β-内酰胺酶的关系

张惠琴，冯体玉，徐韫健

(1梅州市人民医院，广东梅州514031;2广州医科大学附属第一医院)

碳青霉烯类抗生素为临床重要广谱抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌作用强和对包括超广谱β-内酰胺酶(Extended Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs)和头孢菌素酶(AmpC酶)在内的β-内酰胺酶高度稳定的特点，治疗多重耐药革兰阴性杆菌感染效果确切［1］。随该类药物的广泛使用，耐碳青霉烯类抗生素的细菌逐渐增加，其主要耐药机制是可水解碳青霉烯类抗生素的β-内酰胺酶——碳青霉烯酶的产生［2］。为进一步了解耐碳青霉烯类菌株对常见抗生素的耐药性和耐药原因，本研究对2011年6月～2012年6月临床分离的55株可疑产碳青霉烯酶肠杆菌的耐药性及产酶耐药机制进行了分析。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 ①菌株:梅州市人民医院和广州医科大学附属第一医院临床分离的可疑产碳青霉烯酶的肠杆菌55株，菌株选取标准为厄他培南最低抑菌浓度(MIC)≥2μg/mL或哌拉西林/他唑巴坦≥32μg/mL，其中肺炎克雷伯菌28株、大肠埃希菌20株、阴沟肠杆菌7株。标本来源包括痰25份，中段尿16份，导管头沾染物3份，伤口分泌物3份，拭子3份，尿液2份，血液1份，脓液1份，腹水1份。均经VITEK-2全自动细菌鉴定仪统一进行鉴定。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，KPCATCC700603。②主要试剂和仪器:大豆胨肉汤、胰蛋白胨、水解酪蛋白胨(MH)琼脂、厄他培南试纸购自英国Oxid公司;VITEK-2 GNP药敏卡和VITEK-2全自动细菌鉴定仪购自法国梅里埃公司;DNA Marker、PCR配套试剂购自TaKaRa公司;溴化乙锭和琼脂糖购自北京鼎国公司;超高速冷冻离心机购自美国Beckman公司，PCR仪购自德国Eppendorf公司，凝胶成像分析系统购自英国Syngene公司，电泳仪购自北京市六一仪器厂。

1．3 药物敏感试验 采用VITEK-2全自动细菌鉴定仪对临床分离的55株可疑产碳青霉烯酶的菌株进行21种常用抗生素敏感试验。结果判断按照美国临床和实验室标准化研究所(CLSI)2010年准则［3］进行。

1．4 β-内酰胺酶检测 ①改良Hodge试验:将大肠埃希菌ATCC25922涂布至MH平板上(0．5麦氏浊度)、厄他培南纸片贴到平板中央，以接种待检菌的无菌接种环自药敏纸片边缘向平板边缘划向待测菌，注意不要划破平板表面。35℃孵育18～24 h，厄他培南抑菌圈内出现待测菌矢状生长者视为Hodge试验阳性。②AmpC酶三维试验:将大肠埃希菌标准菌株ATCC25922涂布在MH平板上(0．5麦氏浊度)，在平板中央贴一张头孢西丁纸片，自距离纸片5 mm处用无菌刀片在平板的琼脂上向外切一裂隙，每一裂隙中加入30μL待测菌株的β-内酰胺酶粗提物。35℃培养18～24 h，观察裂隙内侧端(头孢西丁纸片的抑菌环内)周围有无细菌生长。判断标准:裂隙内侧端周围有细菌生长、导致头孢西丁纸片的抑菌环有缺失者为阳性。③ESBLs试验:按2010年CLSI推荐的纸片扩散法ESBLs试验指南进行，以KPCATCC700603为质控菌株跟随试验。纸片扩散初筛法:将0．5麦氏浊度菌液均匀涂抹于MH平板，贴上纸片头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟、氨曲南，于35℃温箱中放置18～24 h后观察结果。受试菌对头孢他啶(30μg/片)纸片的抑菌环直径≤22 mm、氨曲南(30 g/片)纸片的抑菌环直径≤27 mm、头孢噻肟(30μg/片)纸片的抑菌环直径 ≤27 mm或头孢曲松(30μg/片)纸片的抑菌环直径≤25 mm，出现其中之一即可视为疑产ESBLs菌株。扩散确证法:对初筛阳性菌株，采用头孢他啶(30μg/片)、头孢他啶/克拉维酸(30 μg/10 μg/片)、头孢噻肟(30μg/片)、头孢噻肟/克拉维酸(30μg/10 μg/片)检测，一对纸片间相距25 mm，于35℃温箱中放置18～24 h后观察结果。任一组药物的抑菌环直径相差≥5 mm，即判定为ESBLs阳性菌株。

1．5 ESBLs表型检测 根据文献和GenBank上已有的序列自行设计ESBLs、AmpC和肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)基因引物，引物由华大基因公司合成，见表1。PCR扩增和产物凝胶成像:PCR反应体系总体积为25 μL，其中正反引物各0．5 μL，Premix Taq 溶液12．5 μL，灭菌蒸馏水10．5μL，DNA 模板1μL。扩增条件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，53～56 ℃ 35 s(见表1)，72 ℃45 s，共循环35次，最后72℃延伸10 min。配制1．0%琼脂糖凝胶，取6μL的 PCR产物点样于琼脂糖凝胶上，100 V电泳40 min，溴化乙锭染色15 min，洗脱后置于凝胶成像系统成像，观察结果。取阳性PCR产物送华大基因公司进行核苷酸序列测定，测序结果在GenBank上进行基因比对。

表1 β-内酰胺酶基因组引物

1．6 统计学方法 采用WHONET5．4及SPSS19．0进行统计学处理。计数资料比较用χ2检验，P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 β-内酰胺酶表型 β-内酰胺酶总检出率为76．36%(42/55)，其中改良 Hodge试验阳性6株(10．91%，肺炎克雷伯菌5株、大肠埃希菌1株)、ESBLs试验阳性27株(49．09%，肺炎克雷伯菌 15株、大肠埃希菌11株、阴沟肠杆菌1株)、AmpC三维试验阳性27株(49．09%，大肠埃希菌6株、肺炎克雷伯菌15株、阴沟肠杆菌6株)。其中产ESBLs+AmpC菌株14株，其他依次为单产ESBLs菌株13株、单产AmpC菌株11株、产AmpC+肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)菌株3株、产ESBLs+AmpC+KPC菌株2株、单产KPC菌株1株。

2．2 β-内酰胺酶基因分布 40株菌(72．73%)检出携带β-内酰胺酶基因，测序产物经BLAST比对与GenBank上登录的 KPC-2、DHA、CIT、TEM、CTX-M基因序列相似度均为99%。详见表2。

表2 不同病原菌β-内酰胺酶基因分布情况(株)

2．3 药敏结果 55株菌株对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢他啶、头孢曲松、氨曲南的耐药率较高，依次为 100．00%、92．73%、90．91%、89．16%、87．27%、87．27%;对丁胺卡那霉素、亚胺培南、美洛培南耐药率较低，分别为 21．82%、27．27%、29．09%。肺炎克雷伯菌与大肠埃希菌总体耐药率相似(阴沟肠杆菌株数少，不作统计比较)，但前者对氨曲南、呋喃妥因耐药率高、后者对环丙沙星耐药率高。详见表3。

3 讨论

革兰阴性杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要有四种，即产生碳青霉烯酶、主动外排系统活跃、产生ESBLs或AmpC酶、外膜蛋白的缺失或数量减少，其中产碳青霉烯酶是细菌耐药的主要机制［7］。KPC是近年发现的一种新型的能够钝化碳青霉烯类抗生素的细菌酶，能够水解碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素，常产生于肺炎克雷伯菌和大肠杆菌。由于KPC酶存在于质粒上，可在细菌间进行水平或垂直传播，已经在世界范围内引起关注，报道的地区和细菌种类也日益增加。本研究显示，55株细菌的β-内酰胺酶总检出率为76．36%，主要来自产ESBLs+AmpC酶菌株，其次为单产ESBLs酶和单产AmpC酶菌株，KPC酶检出率仅为7．27%。提示产碳青霉烯酶并非菌株耐碳青霉烯类药物的主要原因，可能为同时产ESBLs及AmpC酶引起，尚存在其他耐药机制，如外膜蛋白缺失、外排泵的产生、整合子的整合作用等，有待进一步研究。临床上肠杆菌科细菌产ESBLs、AmpC酶最为常见。本研究表1中β-内酰胺酶表型和表2中β-内酰胺酶基因分型结果与此相符。但55株细菌的β-内酰胺酶基因总检出率略低于表型试验，其中3株菌β-内酰胺酶基因阳性、表型为阴性，2株菌β-内酰胺酶表型阳性、基因阴性。出现表型阳性、基因型阴性的原因可能是设计的引物未包括菌株携带的基因型，而表型阴性、基因型阳性者可能原因则为菌株携带基因但不表达β-内酰胺酶。

表3 三种菌株对21种抗生素的耐药率(%)

本研究还显示，55株细菌中改良Hodge试验阳性6株。提示相应菌株产碳青霉烯酶，PCR反应扩增出4株含KPC酶基因(肺炎克雷伯菌3株，大肠埃希菌1株)，经BLAST比对确定为KPC-2基因型。说明广东地区流行的KPC酶主要为KPC-2型，与文献［8］报道相符。此外，6株Hodge试验阳性菌株中5株同时携带 ESBLs或 AmpC酶。有研究［9］报道细菌产KPC酶前已检测到ESBLs或AmpC酶，虽然KPC可通过质粒水平传播，目前鲜见报道KPC和ESBLs、AmpC在基因突变上有直接的关系，但临床产ESBLs、AmpC细菌感染处置不当可能会导致更严重的耐药菌株出现。改良Hodge试验是CLSI推荐的用于筛查KPC型碳青霉烯酶的方法，本研究中此试验与基因检测的符合率为66．67%，未检出KPC酶的2株菌可能产生了除KPC酶外的碳青霉烯酶，如其他A类碳青霉烯酶(GES、SME等)，也可能携带有B类金属酶5类基因型(VIM、IMP、SPM、GIM 和SIM)，或者携带有D类碳青霉烯酶(OXA223、OXA258、OXA240等)。改良Hodge试验亦会出现假阳性，有报道［10］认为，菌株产较多的ESBLs或AmpC可能导致其出现假阳性。本实验中一株细菌为ESBLs和AmpC酶同时阳性，另外一株仅AmpC酶阳性。本研究药敏试验显示，55株细菌耐药率较高的抗生素依次为氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑啉、头孢他啶、头孢曲松、氨曲南，均达87%以上;耐药率较低的依次为丁胺卡那霉素、美洛培南、亚胺培南，均在30%以下。携带KPC-2型基因的菌株除对丁胺卡那霉素敏感外，对其余20种常用的抗生素均显示耐药。

总之，本地区耐碳青霉烯类抗生素的菌株呈不断增加的趋势，目前尚缺乏有效治疗产酶细菌所致感染的方法;建立耐碳青霉烯酶菌株检测体系，及时发现和定期报告本地区耐药菌的流行趋势，合理规范化使用碳青霉烯类抗生素，能够减少产碳青霉烯酶菌株的发生和播散。

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