七叶一枝花提取物抗肿瘤生长及转移的作用

鹿洪秀，马德东

(1山东中医药大学附属医院，济南250012;2山东大学齐鲁医院)

七叶一枝花为百合科植物华重楼的根茎，其很早就出现在治疗肿瘤的方剂中［1，2］。现代药理学研究证实，七叶一枝花提取物具有体外抗肿瘤作用。季申等［3］研究发现，重楼对肺癌、乳腺癌、结肠癌、肾腺癌、胰腺癌均有抑制作用;王强等［4］研究发现，七叶一枝花的甲醇和水提取物对小鼠成纤维细胞有很强的细胞毒性，且随着质量浓度的增大而增强;詹锋等［5］证实，七叶一枝花的水煎液对宫颈癌细胞有明显的抑制作用。以上研究均说明，七叶一枝花在体内和体外均有诱导细胞凋亡的作用。目前的研究多针对七叶一枝花提取液及单体成分的体外抗肿瘤作用，对活体抗肿瘤作用的研究较少，而通过影像学动态观察其对肿瘤生长、转移作用的研究更为少见。2011年1～6月，我们观察了七叶一枝花对体外VX2细胞的影响，并通过MRI观察其对兔移植瘤体积及转移的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 纯种新西兰大白兔50只，体质量(2．4±0．4)kg，购自山东中医药大学附属医院实验动物中心。3．0T MRI购自美国GE公司，采用膝关节线圈扫描。七叶一枝花水煎剂由山东中医药大学附属医院药剂室提供，每毫升含生药1．0 g。VX2细胞来自山东大学医学院遗传学研究所。组蛋白-DNA片断 ELISA试剂盒(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)。

1．2 方法

1．2．1 七叶一枝花对体外VX2细胞的影响 将VX2细胞分为七叶一枝花组及对照组，在含10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，七叶一枝花组培养液中加入七叶一枝花水提液至终浓度为31．25 mg/mL，两组分别在乏氧(约1%O2)及非乏氧条件下培养48 h，收集细胞采用5 mg/mL MTT处理后，读取处理液570 nm的OD值，用以表示相对增殖率;采用ELISA组蛋白-DNA片断试剂盒，按照说明书操作，测量波长405 nm的OD值作为细胞调亡的相对值。

1．2．2 兔移植瘤模型的制备 VX2细胞复苏后注入新西兰大白兔右后下肢肌肉内，肿瘤生长至约3 cm大小后局麻荷瘤兔，取部分瘤体剪刀剪碎至约1 mm大小，取0．5 mL瘤组织悬液(200 mg/mL)经5 mL注射器注入新西兰大白兔右后下肢肌肉内建立模型。建模10 d后MRI T1及T2加权像显示右下肢结节阴影视为模型制作成功。

1．2．3 动物分组及给药 随机将荷瘤兔分为5组、每组10只。A组给予3 mL/(kg·d)七叶一枝花水煎剂灌胃;B组给予1 mL/(kg·d)七叶一枝花水煎剂灌胃;C组给予3 mL/kg七叶一枝花水煎剂灌胃，同时给予3 mg/kg 5-FU耳缘静脉注射，隔日1次;D组给予3 mg/kg 5-FU耳缘静脉注射，隔日1次;E组给予等量生理盐水灌胃。接种后1周开始用药，直到45 d或死亡。

1．2．4 观察指标 分别于建模30、45 d称大白兔体质量，行全身MRI检查，测量肿瘤大小，观察转移灶情况。

1．2．5 统计学方法 采用SPSS13．0统计软件，计量资料以¯±s表示，两组比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 七叶一枝花对体外VX2细胞增殖、凋亡的影响 正常氧分压、低氧培养下，七叶一枝花组VX2细胞增殖率分别为 0．25 ±0．10、0．30 ±0．09，对照组分别为 0．54 ±0．12、0．78 ±0．16，两组比较 P 均＜0．05。正常氧分压、低氧培养下，七叶一枝花组VX2 细胞凋亡率分别为 1．35 ±0．21、0．93 ±0．17，对照组分别为0．62 ±0．18、0．28 ±0．13，两组比较 P均 ＜0．01。

2．2 七叶一枝花在大白兔体内的抑瘤作用 各组体质量、45 d肿瘤体积及转移率比较见表1。

表1 各组体质量、45 d肿瘤体积及转移率比较

3 讨论

兔 VX2 肿瘤属于鳞状细胞癌［6，7］，兔对此瘤缺乏免疫性，建模成功率很高，对研究抗肿瘤药物的疗效及转移十分方便［8］。我们通过下肢肌间注射瘤组织悬液建立了移植瘤模型。低氧诱导因子(HIF-1)是调节细胞氧平衡和诱导乏氧反应基因表达的重要的DNA结合蛋白，为在组织乏氧状态下发挥活性的转录因子，参与乏氧时相应靶基因的调控［9，10］。乏氧是肿瘤对放疗化疗抵抗的重要机制［11，12］，很多抗肿瘤中药在体外实验中显示出良好的效果，但动物试验及临床试验中的疗效并不令人满意。因此通过动物试验筛选验证疗效更强的中药有重要意义。七叶一枝花虽然是一个应用很久的药物，并且有相当多的体外研究，但很多体外证实有效的抗肿瘤药物体内效果无法令人满意。因此，设计合理的体内研究十分重要。本研究的结果证实，七叶一枝花在活体有良好的抗肿瘤生长效果，并且具有很好的抗转移作用。作为抗肿瘤药物抑制肿瘤生长是最基本的要求，七叶一枝花能够满足这一基本要求。七叶一枝花可以明显减少肿瘤的转移，而肿瘤的转移是化疗失败的常见原因。这种现象可以解释很多抗肿瘤中药同常规化疗药物合用时能明显改善预后，减少转移，减缓复发［13］。事实上，现有肿瘤的化疗药物都有很好的肿瘤杀伤作用，中药抗肿瘤药物在这一点上没有特别显著的优势，然而现有的化疗药物对肿瘤的转移均没有理想的效果;本研究首次证实了七叶一枝花在活体的转移抑制作用，可以对常规化疗药物产生有益的补充，这对抗肿瘤中药的推广应用有十分重要的意义。我们推测，中药抗肿瘤药物可以产生的作用并不仅仅是直接杀灭肿瘤，对整个机体和肿瘤内环境的调节可能起了更重要的作用，这一作用可能与中药或中药成分对乏氧有特殊作用有关。

本研究显示，七叶一枝花体内和体外均有抗肿瘤活性，并且使荷瘤兔转移减少，生存期延长。

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［2］高琳琳，李福荣，康莉，等．蚤休皂苷对过氧化损伤致ECV304细胞凋亡机制的研究［J］．中国老年学杂志，2009，29(2):274-277．

［3］季申，周坛树，张锦哲．中药重楼和云南白药中抗肿瘤细胞毒活性物质 Gricillin的测定［J］．中成药，2001，23(2):212-215．

［4］王强，徐国钧．中药七叶一枝花对L929细胞的细胞毒活性研究［J］．中草药，1987，18(11):526．

［5］詹锋，李质怀，刘和强．部分抗癌中药对 hela细胞的抵制实验［J］．兰州医学院学报，2003，29(4):15-16．

［6］Georges E，Breitburd F，Jibard N，et al．Two Shope papillomavirus-associated VX2 carcinoma cell lines with different levels of keratinocyte differentiation and transplantability［J］．J Virol，1985，55(1):246-250．

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