IgA肾病大鼠骨髓内皮祖细胞的变化及意义

郭 伟，冯江敏，姚 丽，刘水仙

(1沈阳市第四人民医院，沈阳110020;2中国医科大学附属第一医院)

IgA肾病(IgAN)是肾小球性血尿最常见的原因，其发病机制尚未完全阐明。Noris等［1］认为，IgAN的致病动因位于骨髓细胞，故其可能是一种干细胞疾病。近年研究发现，IgAN的血管病变是影响患者预后的重要因素［2，3］，而血管病变的基础是内皮细胞损伤。内皮祖细胞(EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，是成年个体中与血管新生关系最为紧密的干细胞成分，参与血管损伤修复及出生后的治疗性血管新生［4］。本研究观察了 IgAN大鼠骨髓EPCs的数量和功能变化，探讨EPCs在IgAN发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1．1 材料 成年雌性8周龄SD大鼠20只，体质量200～250 g，购自沈阳陆军总医院实验动物中心，随机分为IgAN组和对照组各10只。牛血清白蛋白(BSA)，脂多糖(LPS)购自美国Ameresco公司，四氯化碳(CCl4)购自南京化学试剂有限公司，FITC antirat CD34购自美国SANTA CRUZ公司，兔抗大鼠CD133多克隆抗体购自台湾Abnova公司，PE-FLK购自美国BD biosciences公司，DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL)购自美国Molecular probe公司，FITC标记荆豆凝集素Ⅰ(FITC-UEA-1)购自美国Vtorlabs公司，CCK-8购自美国碧云天生物技术研究所，Transwell小室购自美国Corning公司。

1．2 方法

1．2．1 动物分组及模型制备 IgAN模型大鼠制备参照文献［5］方法及预实验，隔天灌服BSA 400 mg/kg，持续6 周;于第6、8 周分别予LPS0．25 mg/kg尾静脉注射;皮下注射蓖麻油 0．5 mL+CCl40．1 mL，1次/周，持续9周。对照组给予等量生理盐水灌胃、尾静脉及皮下注射。两组均正常进食饮水。造模结束后用代谢笼收集24 h尿液，用邻苯三酚红钼酸法测24 h尿蛋白量。取血2 mL，全自动生化分析仪测定血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)。取大鼠肾组织，一部分行OCT包埋，冰冻切片行免疫荧光检测;另一部分用10%中性甲醛固定，石蜡包埋，2μm厚连续切片，行HE染色。

1．2．2 EPCs的分离和培养 采用颈椎脱臼法处死大鼠，用密度梯度离心法获取骨髓单个核细胞，将单个核细胞接种到M199培养基(VEGF 10μg/L、bFGF 5μg/L、EGF 5 μg/L、IGF 5 μg/L、10%胎牛血清)培养3 d，PBS液洗掉非贴壁细胞，换培养液继续培养。

1．2．3 细胞染色 取培养14 d贴壁细胞与DiL-LDL(终浓度为2．4 mg/L)，37℃孵育l h，多聚甲醛固定后，再加FITC-UEA-I(终浓度为10 mg/L)37℃孵育1 h，于显微镜下观察计数，摄取Dil-LDL并结合FITC-UEA-I即染色双阳性者为正在分化的EPCs。

1．2．4 EPCs的表面抗原鉴定 收集贴壁细胞，制备单细胞悬液，调整细胞密度1×107/mL。取细胞悬液100μL于流式管中，加入1μg一抗(CD34、CD133、FLK-1)，加入荧光标记二抗1μg(CD34自带荧光标签不需加二抗)，上流式细胞仪检测。

1．2．5 EPCs迁移能力检测 常规胰酶消化细胞，将细胞稀释成5．0×105/mL的细胞悬液。24孔培养板中加入500μL含生长因子完全培养基，将transwell小室至24孔板上，上室内接种5．0×104个细胞，培养过夜。次日将小室取出，放入4%多聚甲醛固定细胞2 min，用棉签轻轻将小室上室内细胞擦去，加入苏木素染色5 min，蒸馏水浸泡5 min，1%盐酸乙醇分化3 s，自来水流水返蓝20 min，100倍显微镜下观察，进行细胞计数。

1．2．6 EPCs增殖能力检测 常规胰酶消化细胞，进行细胞计数，将细胞稀释成5．0×104/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔加入100μL细胞悬液，置37℃、5%CO2培养箱内培养。分别在48、72 h加入10μL CCK-8试剂，置37℃培养箱中孵育2 h，450 nm处检测各孔吸光度OD值。

1．2．7 统计学方法 采用SPSS17．0统计软件，计量数据用¯x±s表示，组间均数比较采用t检验;相关性分析采用Pearson相关分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 动物模型鉴定 造模结束后，IgAN组大鼠毛色暗，体质量增长缓慢;24 h尿蛋白定量、血清BUN、Scr、IgA水平与对照组相比明显增高(P均＜0．01)。见表1。HE染色可见IgAN组肾组织肾小球系膜细胞增多，系膜基质增宽，部分肾小管上皮细胞浊肿变性，肾小管形态不规整;免疫荧光见肾小球系膜区以IgA沉积为主。对照组肾组织未见明显异常，免疫荧光阴性。

2．2 EPCs的表型鉴定 取培养14 d细胞，荧光标记流式细胞仪检测细胞表面标志物，结果显示，表达FLK-1为(47．78±6．24)%，表达 CD34 为(38．83 ±3．67)%，表达 CD133 为(44．89 ±2．35)%，证实培养细胞为EPCs。

表1 两组造模结束后体质量、24 h尿蛋白定量及血清BUN、Scr、IgA水平比较(¯x±s)

2．3 两组细胞数量比较 激光共聚焦显微镜观察，DiI-ac-LDL染色阳性为红色荧光，FITC-UEA-1染色阳性为绿色荧光，染色双阳性为黄色荧光。染色双阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。对照组和IgAN 组的 EPCs数量分别为(42．8 ±10．5)、(28．0±8．0)/HP，组间比较 P ＜0．05。

2．4 两组细胞增殖能力比较 细胞培养48 h时对照组和 IgAN 组的 OD 值分别为0．65±0．03、0．53±0．17;72 h 时两组 OD 值分别为0．75 ±0．14、0．61 ±0．01。两组比较 P 均 ＜0．01。

2．5 两组细胞迁移能力比较 对照组迁移到下室的细胞数为(552±43)/LP，IgAN组为(505±30)/LP，两组比较 P ＜0．01。

2．6 相关性分析 Pearson相关分析显示，IgAN大鼠骨髓EPCs数量与血清BUN、Scr、IgA、24 h尿蛋白定量呈负相关(r分别为 －0．49、－0．65、－0．81、－0．95，P 均 ＜0．05)。

3 讨论

IgAN是我国慢性肾衰竭重要病因之一，约25%的患者在确诊后5～25年内发展为终末期肾脏病。不同地区IgAN的发病率不同，以亚洲及澳洲发病率最高。研究认为，IgAN的发病与免疫反应、炎症介质、遗传因素等多种因素密切相关。还有学者认为，IgAN发病与骨髓干细胞有关。骨髓中主要存在3种干细胞，即造血干细胞、间充质干细胞和EPCs。已有研究报道，造血干细胞和间充质干细胞均参与了IgAN的发病［6～8］。EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，主要来源于脐静脉血、成人外周血和骨髓，是成年个体中与血管新生关系最为紧密的干细胞成分［9，10］。研究发现，在内源性或外源性刺激因素作用下，EPCs可从骨髓动员释放至外周血循环，分化为成熟血管内皮细胞，参与人体组织器官损伤后的血管再生与修复，在受损血管恢复和缺血组织的再血管化过程中发挥重要作用［11，12］。但IgAN是否存在骨髓EPCs损伤目前尚无报道。

本研究成功制备IgAN大鼠模型，大鼠出现血尿、蛋白尿以及肾功能减退，肾组织病理见肾小球系膜细胞增多、系膜基质增宽等改变，免疫荧光显示肾小球系膜区以IgA沉积为主，符合IgAN的特征;与对照组比较，IgAN组EPCs数量减少约33%，细胞迁移能力下降约10%，增殖能力下降约18%。骨髓EPCs数量减少可能导致动员到血循环的EPCs减少，而迁移能力的下降将直接降低干细胞或EPCs的动员和归巢能力［13］，增殖能力下降说明细胞活力降低。

肾脏微循环损伤是IgAN发生发展的重要因素，血管病变的病理生理基础是血管损伤后新生内膜过度增殖及内皮功能不全。内皮功能障碍的本质是内皮损伤和修复之间的动态平衡被破坏，传统观念认为，只能依靠损伤血管内皮邻近的内皮细胞分化、增殖来参与损伤处内皮再生。近年研究表明，血管损伤后除局部血管壁细胞参与损伤血管修复外，骨髓EPCs也可以通过归巢、整合于受损的血管丛，直接分化为内皮细胞家族细胞;还可以直接分泌VEGF等细胞因子，通过旁分泌的方式促进局部缺血组织的血管新生，并在此基础上形成有完全功能的血管［14］。IgAN动物模型骨髓EPCs数量和功能显著受损，内皮细胞将无法得到及时有效的更新和损伤修复，组织缺血缺氧难以改善。组织缺血缺氧虽不是IgAN发病的始动因素，但对于疾病的持续发展有重要影响。本研究也发现，IgAN动物模型的肾功能、血IgA水平与骨髓EPCs数量呈负相关。另外还应注意某些致病因素，如免疫复合物、炎症介质等可能对EPCs数量和功能产生影响，从而形成恶性循环。

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