细胞周期调节因子在乳腺导管增生性疾病及乳腺癌中的表达及意义

武彤彤吴春莲罗京华黄卓雅杨清绪

（1 惠州市中心人民医院病理科，广东 惠州 516001；2 惠州市中医医院药剂科，广东 惠州 516001）

细胞周期调节因子在乳腺导管增生性疾病及乳腺癌中的表达及意义

武彤彤1吴春莲1罗京华2黄卓雅1杨清绪1

（1 惠州市中心人民医院病理科，广东 惠州 516001；2 惠州市中医医院药剂科，广东 惠州 516001）

目的 研究共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（Ataxia-Telangiectasa mutated protein，ATM protein）、检测点激酶2（Checkpoints kinase1，Chk2）及P53在乳腺浸润性导管癌（invasive ductal carcinoma，IDC）、导管内癌（ductal carcinoma in situ，DCIS）、非典型导管增生（atypical ductal hyperplasia，ADH）、癌旁正常乳腺组织（normal brease tissues adjacent to cancer，NBTAC）中的表达情况，探讨其在乳腺癌发生发展中的作用。方法 采用免疫组化S-P法检测 63例乳腺浸润性导管癌、39例导管内癌、42例非典型导管增生、56例癌旁正常乳腺组织中ATM、Chk2及P53的表达情况。结果 ATM、Chk2在乳腺浸润性导管癌中的表达明显低于癌旁正常乳腺组织；P53在乳腺浸润性导管癌中的表达明显高于癌旁正常乳腺组织；ATM、Chk2与P53表达呈显著负相关。结论 乳腺浸润性癌ATM、Chk2表达缺失及P53的表达增高可能是乳腺癌发生、发展的重要因素之一，联合检测对早期乳腺癌的诊断及判断乳腺癌预后有指导意义。

乳腺癌；共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（ATM）；检测点激酶2（Chk2）；P53；免疫组织化学

乳腺癌是常见的妇科肿瘤之一，严重威胁着妇女的健康。研究表明癌症的发生是多因素共同作用的结果，其中基因突变占有重要地位。本研究将应用免疫组织化学方法检测毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白（ATM）、细胞周期检查点激酶2（Chk2）及P53在乳腺浸润性癌、导管内癌、非典型导管增生、癌旁正常乳腺组织中的表达情况，它们在乳腺癌中的作用及相互之间的关系探讨其在乳腺癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 临床资料

选取我院病理科2006～2010年的乳腺癌患者（均经病理证实为乳腺浸润性导管癌）的乳腺活检组织石蜡包埋标本63例，同时选取我院2006～2010年确诊的导管内癌39例，非典型导管增生42例，癌旁正常组织56例。

1.2 实验方法

采取免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），一抗包括鼠源ATM单克隆抗体（美国Zymed公司），兔源Chk2、P53多克隆抗体（美国Zymed公司）。按试剂盒说明书进行操作。免疫组化结果：ATM、Chk2与P53阳性染色定位于细胞核，均为出现黄色到棕褐色颗粒。阳性细胞（10个高倍视野）≤25%计1分，26%～75%计2分，≥76%计3分；阳性细胞的着色强度按无着色、黄色、棕黄色和棕褐色分别判为0、1、2、3分。根据两项积分之和判断结果，0分为阴性（-），1—2分为弱阳性（+），3-4分为中度阳性（++），5-6分为强阳性（+++）。+视为低表达，++、+++视为高表达。

1.3 统计学分析

运用SPSS（10.0 for window）软件进行统计学处理。采用χ2检验、非参数Spearman等级相关检验。

2 结 果

2.1 ATM、Chk2及P53的表达情况在乳腺浸润性导管癌（IDC）、导管内癌（DCIS）、非典型导管增生（ADH）、癌旁正常组织（NBTAL）中表达及阳性率（表1）。ATM（图1）、Chk2及P53（图2）阳性信号呈黄色到棕黄色颗粒状。

表1 ATM、Chk2与P53蛋白表达情况

2.2 ATM、Chk2及P53表达结果 ⑴ATM、Chk2蛋白的表达结果。在浸润性导管癌的阳性率分别为57.1%、55.6%，明显低于癌旁正常组织76.7%、73.2%，两种之间存在显著差异（P＜0.05）；在浸润性导管癌的阳性率分别为57.1%、55.6%，在导管内癌的阳性率分别为61.5%、58.9%，在非典型导管增生的阳性率分别为61.9%、59.5%，浸润性导管癌与导管内癌之间，浸润性导管癌与非低典型导管增生之间均是差异无统计学意义（P＞0.05）。⑵P53蛋白的表达结果 在乳腺浸润性导管癌的阳性率为49.2%，在导管内癌的阳性率为28.2%，在非典型导管增生的阳性率为30.9%，在癌旁正常乳腺组织中阳性率为10.7%；在浸润性导管癌与癌旁正常组织之间、浸润性导管癌与导管内癌之间、导管内癌与癌旁正常组织之间、非典型导管增生与癌旁正常组织之间均存在显著差异（P＜0.05）。⑶在乳腺浸润性导管癌、导管内癌中的P53与ATM、Chk2表达之间存在显著负相关。

图1 ATM在癌旁正常乳腺组织中导管上皮阳性表达（SP法，×100）

图2 P53在浸润性导管癌中癌组织阳性表达（SP法，×100）

3 讨 论

共济失调毛细血管扩张症突变蛋白（Ataxia-Telangiectasia mutated protein，ATM protein），为一种丝/苏氨酸蛋白激酶，含有3056个氨基酸残基，是一种大分子量蛋白，相对分子质量约为370×103[1]。ATM蛋白激酶是一种自动磷酸化蛋白，分布于细胞核和细胞质内，以细胞核为主，在高等真核生物体组织细胞内普遍存在，一些组织细胞如睾丸、脾脏、胸腺等组织内高表达。通常情况下，ATM蛋白激酶以无活性的二聚体形式存在。

ATM蛋白激酶在维护整个基因组的稳定性中充当重要的角色。应对DNA损伤物，ATM激活不同的效应底物，发挥细胞周期调控、DNA修复和细胞凋亡等作用。ATM蛋白激酶是DNA损伤修复过程的关键调控者，它主要参与：①激活细胞周期检测点。ATM蛋白激酶参与DNA损伤后，激活多个复杂的细胞周期检测点，包括：G1/S检测点、S期检测点、G2/M检测点[2]。其信号通路有两条：一条激活Chk1，Chk1引起CDC25的Ser216磷酸化，通过抑制CDC25的活性，抑制M-CDK的活性，细胞周期中断；另一条是激活Chk2[3]，使抑癌基因P53被磷酸化而激活。这些活化的P53、Chk2等参与抑制磷酸化Tyr-15位点的脱磷酸化有关，最终使细胞不能通过检查点“关卡”而导致细胞周期的阻滞。Squatrito[8]等通过对小鼠脑胶质瘤模型研究，发现ATM/Chk2/P53通路成分异常能抑制肿瘤的形成和增加肿瘤对放射线的抵抗性。②DNA的修复。ATM蛋白激酶监视DNA的损伤并且通过磷酸化激活相关的蛋白，调节众多方面的DNA损失应答过程[4、11]。当ATM蛋白激酶发生突变、失活和功能受损后，细胞缺乏功能正常的ATM蛋白激酶，不能正常修复受损的DNA，受损的DNA很容易随细胞分裂而传人子细胞，最终易导致癌变。③参与细胞凋亡。ATM蛋白激酶可以通过调节DNA损失与死亡受体信号传递之间的相互作用介导肿瘤细胞凋亡[9]。

Chk2是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，有一定的底物特异性。Chk2是ATM的作用靶点，在DNA损伤后，ATM识别损失信号，继而使Chk2获得充分的活性，应对各种原因造成的DNA的损伤[7]。

研究表明在正常乳腺组织的上皮中，ATM蛋白激酶只表达导管上皮分泌细胞，而肌上皮细胞几乎不表达。而在30%～50%的浸润性乳腺癌肿瘤细胞中ATM表达下降或缺失[5]。ATM与Chk2在细胞核内调控细胞周期的功能一致[6]。在本研究中，ATM、Chk2在乳腺浸润性癌中的表达明显低于正常组织。

DNA损伤导致的细胞凋亡必须要P53的参加，P53基因突变是目前所知人体肿瘤中最常见的基因改变。P53基因突变后不仅丧失抑癌功能，而且具有癌基因的特征。而免疫组化检测到的是以突变型为主的P53蛋白。在本研究中，P53在在乳腺浸润性癌中的表达明显高于正常组织。P53在正常乳腺组织中的表达明显低于导管内癌，而导管内癌中的表达低于乳腺浸润性癌。P53与ATM、Chk2表达之间存在显著负相关[10]。

综上，ATM蛋白激酶、Chk2、P53的表达及相互之间的关系，它们在乳腺癌发生、进展中的作用，还有待于进一步的研究与探索，还需要进一步加大样本量，而且对某些技术与方法的应用也有待于进一步的改善、改进和建立。ATM蛋白激酶表达或活性改变涉及了肿瘤的发生，并影响肿瘤的治疗及预后，提示ATM蛋白激酶或许能成为肿瘤治疗过程中一个新的作用靶点，为肿瘤治疗开辟更广阔的空间。

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Expression and Significance of Cell Cycle Regulators in Breast Intraductal Proliferative Diseases and Breast Carcinoma

WU Tong-tong1, WU Chun-lian1, LUO Jing-hua2,HUANG Zhuo-ya1,YANG Qing-xu1
(1 Department of Pathology, Huizhou Municipal Central Hospital, Huizhou 516001, China; 2 Department of Pharmacy, Huizhou Central Hospital, Huizhou 516001, China)

Objective This study investigate the expression of cell cycle regulators , including ATM、Chk2 and p53 in breast carcinoma. Methods The expressions of ATM、Chk2 and p53 in 63 cases of breast invasive ductal carcinoma (BIDC)、39 cases of breast carcinoma in situ (BIDC)、42 cases of atypical ductal hyperplasia (ADH) and 56 cases of normal breast tissues adjacent to cancer (NBTAC) were observes by SP immunohistochemistry. Results The positive expression levels of ATM and Chk2 in BIDC were significantly lower than NBTAC (P＜0.05). The positive expression level of P53 in BIDC was significantly higher than NBTAC (P＜0.05). Conclusion These results suggest that down-regulation of ATM and Chk2, and over-expression of P53 are significantly related to genesis and progression of breast carcinoma. Combined determination of these three proteins may play an important role in diagnosis and prognosis of breast carcinoma.

R737.9

B

1671-8194（2013）19-0001-02

惠州市科技计划项目（编号：20110807）