不同浓度肿瘤坏死因子-α对肺腺癌A549细胞的影响

徐采云，李 理，袁伟锋，黄文杰

(1南方医科大学，广州510515;2广州军区广州总医院)

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)常用于复制炎症、凋亡相关的动物和细胞模型。近年研究发现，TNF-α能促进活性氧(ROS)的产生［1，2］，其产生量的多少反映了氧化应激水平的高低。以往我们研究发现，ROS与TNF-α存在浓度依赖，随TNF-α浓度增加，细胞内ROS产生的量随之增加。Tonks等［3］研究发现，ROS含量低的氧化应激编码抗氧化酶的Nrf-2活化，细胞受到保护;ROS含量较高的氧化应激通过活化NF-κB和AP-1诱导炎症反应;而ROS含量更高的氧化应激主要导致细胞的凋亡。基于此，我们提出了不同浓度TNF-α可能产生保护、促炎、促细胞凋亡等不同细胞效应。2012年2～12月，我们观察了不同浓度TNF-α对肺腺癌A549细胞的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 肺腺癌A549细胞由广州军区总医院医学实验科保存，人重组TNF-α购于以色列Prospec公司，引物由英潍捷基生物技术有限公司合成，逆转录试剂盒及PCR酶购于宝生物工程(大连)有限公司，DAPI试剂购于碧云天生物技术有限公司，MTT及ROS检测试剂购于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 用RPMI 1640培养基加10%小牛血清培养肺腺癌A549细胞，置37℃ 5%CO2孵箱中孵育。细胞生长至80%时融合传代。选择传3～5代细胞用于实验，调整细胞密度至5×105/mL，接种于6孔板中，培养基中加入终浓度为100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素。

1.2.2 细胞存活率检测 采用MTT比色法。根据TNF-α 诱导浓度不同，设 TNF-α 0(对照组)、1、10、25、50、100 ng/mL组，每组设3个复孔。将细胞密度调整为1×105/mL接种至96孔板，100μL/孔，生长24 h后更换无血清培养基，2 h更换相应TNF-α终浓度的培养基，继续培养6 h。每孔加入 10μL MTT(终浓度为5 mg/L)。继续培养4 h后，每孔加入100μL Formanzan溶解液在细胞培养箱孵育4 h，用酶标仪检测570 nm光吸收值(OD)。细胞存活率=(实验组OD－空白组OD)/(对照组OD－空白组OD)。

1.2.3 ROS检测 取对数生长期肺腺癌A549细胞，接种于 24 孔板，分别以 0、1、10、25、50 ng/mL TNF-α处理6 h，PBS洗涤3次，加入无血清培养基稀释成1∶1 000 DCFH-DA探针继续孵育1 h，PBS洗涤3次后，萤光酶标仪观察各组ROS强度。

1.2.4 Nrf-2、NF-κB mRNA 表 达 检 测 采 用RT-PCR法。取对数生长期肺腺癌A549细胞，接种于25 cm2培养瓶中，分别以 0(对照组)、1、10、25、50 ng/mL TNF-α处理6 h。裂解细胞提取RNA进行逆转录。人 NF-κB［4］:上游引物:5'-GGGAAGGAACGCTGTCA-3'，下游引物:5'-TAGCCTCAGGGTACTCCAT-3'，片段长204 bp;人 Nrf-2:上游引物:5'-ATTGCCTGTAAGTCCTGGTCA-3'，下游引物:5'-ACTGCTTTGGACACATTTCG-3'，片段长 180 bp;人β-actin:上游引物:5'-AGGGAAATCGTTGCGTGACATCA-3'，下游引物:5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3'，片段长 476 bp。按照 95 ℃ 30 s、52 ℃30 s、72℃ 30 s进行35个循环后，行凝胶电泳，用BIO-RAD凝胶成像系统采集图像，Gel-Pro Analyzer 32进行灰度值测定。

1.2.5 细胞凋亡观察 在24孔板中放置灭菌玻片，取细胞密度1×105/mL的肺腺癌 A549细胞1 mL接种至孔板中，分别设 TNF-α0(对照组)、1、10、25、50 ng/mL组，每组设3个复孔。培养24 h后更换无血清培养基，2 h后更换相应TNF-α终浓度的培养基，继续培养6 h。按照DAPI细胞核荧光染色法处理细胞，荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，多重比较用One-Way-ANOVA检验，方差齐用LSD检验，方差不齐用Tamhane检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度TNF-α对肺腺癌A549细胞存活率的影响 TNF-α 1、10、25、50 ng/mL组细胞存活率分别为(113.3 ±2.0)%、(94.7 ±1.8)%、(93.8 ±0.3)%及(90.0±2.0)%，与对照组比较差异均无统计学意义(P均＞0.05)。TNF-α100 ng/mL组细胞存活率为(78.0±1.3)%，与对照比较差异有统计学意义(P＜0.05)。说明TNF-α0～50 ng/mL对肺腺癌A549细胞无毒性作用，故后续实验不再设100 ng/mL组。

2.2 不同浓度 TNF-α对肺腺癌 A549细胞产生ROS的影响 DCFH-DA染色后，荧光酶标仪检测结果显示，对照组ROS平均荧光强度(MFI)为177.0±10.6;TNF-α 诱导后，ROS MFI较对照组均有升高，其中1 ng/mL 组 MFI为 183.3 ±7.6、10 ng/mL组为361.3 ±36.0、25 ng/mL 组为 525.0 ±25.0、50 ng/mL组为693.0±19.3。表明肺腺癌 A549细胞ROS的产生随 TNF-α浓度增加而升高(P均 ＜0.05)。

2.3 不同浓度 TNF-α 对 Nrf-2、NF-κB mRNA 表达的影响 Nrf-2的表达随TNF-α浓度增加表达下调(P 均 ＜0.05)，NF-κB 的表达随 TNF-α 浓度的增加而增加(P均＜0.05)。见表1。

表1 不同浓度TNF-α对Nrf-2、NF-κB mRNA表达的影响(¯x ±s)

2.4 不同浓度TNF-α对肺腺癌A549细胞凋亡的影响 DAPI染色后，荧光显微镜观察显示，随着TNF-α刺激浓度的增加，细胞核染色加深，出现核浓缩(25 ng/mL组)等早期凋亡的特征，甚至出现核碎裂成大小不等的圆形小体(50 ng/mL组)等晚期凋亡的表现。说明TNF-α诱导肺腺癌A549细胞凋亡的能力也存在浓度依赖性。见图1。

图1 TNF-α对肺腺癌A549细胞凋亡的影响(n=3)

3 讨论

TNF-α是由巨噬细胞分泌的一种具有复杂生物活性的细胞因子，对多种体外培养的肿瘤细胞具有细胞毒活性，已经作为抗肿瘤药物应用于临床。临床已证实，TNF-α进入肿瘤细胞是沿微管移动与溶酶体结合，使溶酶体破裂，释放出溶酶体酶导致细胞自溶，且对正常组织细胞无影响。目前，TNF-α作为一种多功能的细胞因子，应用于急慢性炎症、肿瘤等疾病中。

关于TNF-α信号通路的研究表明，TNF-α能通过活化编码抗氧化酶基因抑制JNK活化，增强细胞存活能力［5］;TNF-α 能诱导 ROS的产生，使 MKPs失活，从而导致JNK活化及细胞凋亡［6］。本实验室用TNF-α复制急性肺损伤细胞模型过程中也发现，TNF-α处理细胞后，既能活化编码抗氧化酶的Nrf-2基因，产生细胞保护作用;又能活化炎症因子NF-κB，甚至促进凋亡。

NF-κB是炎症反应中被激活的重要转录因子，其激活后迅速从胞质转位于细胞核内，启动和调控多种蛋白的表达［7］。本研究中，随着TNF-α刺激浓度增加，NF-κB mRNA表达增强，提示 TNF-α浓度增加能导致细胞炎症水平增加，这与Kim等［8］研究结果相同。Nrf-2是编码抗氧化酶的基因，它的活化能促进细胞抗氧化能力，保护细胞免受过度的氧化损伤。本实验中，Nrf-2 mRNA表达随TNF-α浓度增加而降低，提示细胞抗氧化损伤的能力下降。

本研究还发现，TNF-α刺激浓度与细胞胞内ROS生成量呈正相关，TNF-α浓度越高，ROS的生成量越高。Kim等［9］研究也有相同的结论。有关ROS作用的研究提示，细胞产生的ROS超过其抗氧化能力时，氧化应激状态会导致细胞损伤和疾病的产生;产生的量不多时，ROS作为第二信使调控基因的表达［10，11］。由此可知，ROS 生成量的不同，产生的生物学效应也不同，而TNF-α与ROS之间存在浓度依赖关系。因此，TNF-α处理后的肺腺癌A549细胞产生了不同的细胞效应，可能与ROS的产生量不同有关。

综上所述，不同浓度TNF-α对肺腺癌A549细胞有不同的细胞效应，其机制可能与不同浓度TNF-α使肺腺癌A549细胞产生ROS的量不同有关。

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