虾青素对大鼠海马神经元细胞的保护作用

俞正霞，曲 毅，陈弘群，毕明慧，何 悦

(上海市徐汇区中心医院，上海200031)

阿尔茨海默病(AD)是中枢神经系统退行性疾病，主要临床表现为记忆、认知等智能障碍，目前对其病因及发病机制尚不十分清楚［1］。AD的主要神经病理特征是在海马组织区域出现淀粉样斑块，其斑块的主要成分是β样淀粉蛋白(Aβ)，Aβ在海马区域过度沉积可引起自由基产生、炎症因子分泌及神经元损伤。大脑缺血缺氧是Aβ合成增加的诱因之一，缺氧时产生的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)能启动下游的淀粉样前体蛋白(APP)、β-分泌酶、γ-分泌酶等基因表达，导致 Aβ 过度沉积，诱发 AD［2，3］。抗氧化剂能有效缓解大脑缺血缺氧，阻止HIF-1α产生，对海马神经元细胞起一定保护作用，减少AD发生。虾青素是近年发现的、有效的抗氧化剂［4］，为探讨虾青素对海马神经元细胞的保护机制，为虾青素临床治疗AD提供理论依据，2012年我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠10只，8日龄，体质量(12±3)g，由中科院上海实验动物中心提供。虾青素、Aβ25-35购自Sigma公司;PUS-2018G半自动生化仪购自普朗医疗器械公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离及培养 10只大鼠用70%乙醇消毒，用剪刀剪下头部，将无菌分离的海马组织置入150 mL生理盐水中;用镊子分离海马无关组织，用生理盐水悬浮沉淀，仔细去除血管、筋膜及非海马结构;然后将海马组织置入0.125%的胰酶中消化，用弯头吸管边消化边吹打，消化时间20～30 min。胰酶消化后，用含有2%B27的神经细胞培养液吹打均匀，24 h后换神经细胞培养液，培养海马神经元细胞。对照组在海马神经元细胞中加入5 mmol/L的Aβ25-35诱导24 h，建立AD模型;治疗组在海马神经元细胞中分别加入虾青素5、10、20μg/μL(虾青素5、10、20 μg/μL 组)，然后分别加入 5 mmol/L 的Aβ25-35诱导24 h。

1.2.2 检测指标 收集海马神经元细胞，采用噻唑蓝比色法检测细胞存活情况;用半自动生化仪检测细胞的抗氧化指标超氧化物歧化酶(SOD)及脂质过氧化物(MDA);RT-PCR法检测细胞HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的 mRNA 表达，Western blot法检测细胞 HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的蛋白表达。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，数据以¯x±s表示，组间比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组海马神经元细胞存活率比较 对照组海马神经元细胞存活率为(0.65±0.02)%，虾青素5、10、20 μg/μL 组分别为(0.76 ± 0.03)%、(0.87 ±0.02)%、(0.97 ±0.03)%。随着虾青素浓度升高，海马神经元细胞的存活率明显升高(P均＜0.01)。

2.2 各组海马神经元细胞的抗氧化指标比较 见表1。

表1 各组海马神经元细胞的抗氧化指标比较(¯x±s)

2.3 各组海马神经元细胞HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的mRNA表达比较 见表2。

2.4 各组海马神经元细胞的 HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的蛋白表达比较 见表3。

3 讨论

Aβ合成增加并沉积形成斑块是AD发病的主要机制［2］。因此，减少Aβ合成、减少斑块形成是防治AD的关键。大脑缺血缺氧时可诱导HIF-1α产生，HIF-1α 又可促进 APP、β-分泌酶、γ-分泌酶表达;APP是 Aβ的前体蛋白，其可在 β-分泌酶、γ-分泌酶作用下剪切为Aβ，故HIF-1α是Aβ合成的重要诱因之一［2，3］。另外，Aβ过度沉积也可诱发自由基产生，对神经元细胞产生毒性。因此，通过抗氧化剂治疗既可通过减轻大脑的缺血缺氧状态抑制HIF-1α表达，减少Aβ合成;又可通过提高神经元细胞内SOD活性，减少MDA产生，对细胞起到保护作用。

表2 各组海马神经元细胞的HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶基因mRNA表达比较(¯x±s)

表3 各组海马神经元细胞HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的蛋白表达比较(¯x±s)

虾青素是类胡萝卜素族成员，是虾壳红色色素的主要成分。近年来，有关虾青素有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节作用的报道逐渐引起临床关注［5，6］。本研究观察了不同浓度虾青素对大鼠海马神经元细胞的保护作用，检测了其对大鼠海马神经元细胞HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶的基因及蛋白表达影响，结果发现，随着虾青素浓度升高，海马神经元细胞的存活率明显升高，HIF-1α、APP、β-分泌酶、γ-分泌酶mRNA表达及蛋白表达明显降低;提示虾青素对Aβ合成具有抑制作用。虾青素是强抗氧化剂，研究表明，虾青素能明显提高海马神经元细胞中的SOD表达和活性，有效清除其细胞中的MDA，从而对细胞产生保护作用。本研究显示，随着虾青素浓度升高，海马神经元细胞的抗氧化作用明显升高，其中虾青素20μg/μL组海马神经元细胞的SOD活性比对照组提高7倍，MDA比对照组降低5倍;说明虾青素对海马神经元细胞有很好的保护作用，能有效地清除氧自由基，提高细胞的存活率和活性。

综上所述，我们认为虾青素作为一种强抗氧化剂，在临床治疗AD上具有较好的应用前景。

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