丹参酮ⅡA对化疗治疗非小细胞肺癌的疗效及P-gp表达的影响*

郭忠聪 谢 琼

（湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410003）

原发性支气管肺癌（肺癌）在我国大中城市的发病率及死亡率均居癌症首位。其中非小细胞肺癌（NSCLC）患者占到80%左右，目前最好的化疗方案治疗的总有效率为40%～50%［1-2］。大量实验研究表明，丹参酮ⅡA具有抗肿瘤的作用［3］，其作用机制多种多样，其中包括通过抑制DNA合成、阻滞细胞周期、上调凋亡基因促进肿瘤细胞凋亡、对原癌基因表达起到抑制的影响、抑制相关酶的表达以及逆转多药耐药来体现其抗肿瘤作用［3-4］。但关于丹参酮ⅡA的研究主要集中在实验研究，而对于其在临床的效果仍有待进一步的临床研究来验证。本课题前期动物实验已证明了丹参酮ⅡA能显著提高抑瘤率及肿瘤细胞凋亡，并发现其逆转耐药作用机制可能与降低P-gp、LRP、TOPOⅡ表达有关［5］。故本研究试图通过观察丹参酮ⅡA联合TP方案治疗NSCLC的疗效，来探索丹参酮ⅡA在临床上的抗肿瘤效果，并试图从P型糖蛋白定性变化的角度来初步探讨丹参酮ⅡA临床上逆转多药耐药的可能机制。

1 资料与方法

1.1 病例选择（1）经细胞学或病理学确诊为NSCLC；不能手术治疗或不愿接受手术治疗的患者；（2）年龄＜75 岁且>18 岁，性别不限，Karnofsky 评分［6］≥70分，治疗前血常规、肝肾功能、ECG基本正常，预计生存期>6个月，有可测量的客观病灶指标；（3）签署知情同意书（患者愿意接受本方案治疗 ，能按医嘱坚持用药，依从性好者），住院患者，符合伦理学标准；（4）入组前，采外周静脉血2 mL，分离淋巴细胞，以流式细胞技术检测细胞膜P-gp蛋白含量，定性为阴性。

1.2 临床资料全组共64例，男性37例，女性27例；年龄 41～74 岁，平均（59.75±6.13）岁；病理类型为腺癌30例，鳞癌28例，腺鳞癌6例；TNM分期为Ⅱa期2例，Ⅱb期6例，Ⅲa期6例，Ⅲb期12例，Ⅳ期38例。随机分为治疗组与对照组各32例，两组资料差异无统计学意义（P>0.05）。

1.3 P-gp的检测、试剂及药品外周血淋巴细胞提取及制备参见文献［7］。取静脉血2 mL，以2%乙二胺四乙酸钠（EDTA）抗凝（1∶9），加入淋巴细胞分离液 2 mL，以1500 r/min离心5 min，提取淋巴细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，1500 r/min 离心 5 min，2 次，去上清，70%乙醇固定。检测前，先以PBS漂洗样品悬液1次，1500r/min离心5 min，以除去固定剂，调整悬液细胞数在109/L左右，再将每份悬液分别加入两试管中，其一加入20 μL MRKl6，其二加入20 μL羊抗鼠IgG（以排除非特异免疫反应误差），室温放置20 min，2000 r/min，离心5 min，共3次，再向两试管中分别加入20 μL羊抗鼠IgGFIFC，室温避光放置30 min，2000 r/min离心5 min，3次，PBS漂洗，待检。流式细胞仪P-gp检测：使用FACScan型流式细胞检测仪，收集2万个淋巴细胞进行检测，在Macintosh 650型计算机上应用Cell Ques.Plot软件（美国BD公司）分析数据结果。P-gp含量以P-gp阳性细胞百分率表示，计算公式为：P-gp阳性细胞%=P-gp阳性细胞数／（P-gp阳性细胞数+P-gp阴性细胞数一非特异结合细胞）×100%。P-gp阳性判断标准：取正常人外周血淋巴细胞P-gp含量的95%可信限，即均值+标准差为界值×2，检测值大于此值判断为P-gp阳性，小于或等于此值判断为阴性［8］。鼠抗人P-gp单克隆抗体MRK16、免疫阴性对照抗体羊抗鼠IgG及羊抗鼠IgG-FITC（异硫氰酸荧光素标记）为法国国际免疫公司销售产品。淋巴细胞分离液购自中国科学院血液研究所。紫杉醇脂质体粉针剂（厂家：南京思科药业有限公司，规格：30 mg/瓶）；顺铂粉针剂（山东齐鲁制药有限公司，规格：10 mg/支）；丹参酮ⅡA注射液（厂家：上海第一生化药业有限公司，规格：10 mg/支）。

1.4 治疗方法治疗组给予TP方案（TAXOL150mg/m2，静注，d1；DDP 60 mg/m2，静注，d1），化疗同时采用丹参酮ⅡA注射液60 mg入液静滴，每日1次，持续2周（化疗当日不用）。对照组仅行TP方案化疗。滴注TAXOL前12 h及6 h分别口服地塞米松20 mg，30 min前以苯海拉明50 mg，西米替丁0.4 g，分别入液静滴。常规止呕、水化处理。出现骨髓抑制（Ⅱ度以下）后给予粒细胞集落刺激因子（G-CSF）皮下注射。两组在观察期间均不使用其他影响抗肿瘤中药以及影响免疫的药。3周为1个周期，观察2个周期。

1.5 疗效评价标准

1.5.1 生活质量评定 依据 《中药新药临床研究指导原则》［9］中关于以Karnofsky评分标准为指标评价生活质量变化情况，根据治疗前后的分值判定疗效，以KPS评分增加10分以上者为增加，下降10分以上者为下降，两者之间为稳定。

1.5.2 实体瘤的疗效评价标准（RECIST）［10］可测量的目标病灶如下。CR：所有目标病灶消失，无新病灶出现，并维持4周。PR：基线病灶长径总和缩小 ≥30%，并维持4周。SD：基线病灶长径总和有缩小但未达PR或有增加但未达PD。PD：基线病灶长径总和增加≥20%或出现新病灶。非目标病灶，CR：所有非目标病灶消失和肿瘤标志物水平正常。PD：出现一个或多个新病灶或/和存在非目标病灶进展。SD：一个或多个非目标病灶和/或肿瘤标志物高于正常持续存在。再评价总疗效。 有效率=（CR+PR）／总例数。

1.5.3 P-gp定性比较 治疗前后P-gp定性的变化。1.6 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。统一采用α=0.05双侧检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生活质量的比较治疗后两组患者生活质量（KPS评分）改善情况的比较，治疗组增加18例，稳定10例，下降4例，对照组增加10例，稳定12例，下降10例。两组差异无统计学意义（P>0.05）。

2.2 实体瘤疗效比较见表1。结果示对照组有效率高于对照组（P＜0.05）。

表1 两组治疗后患者实体瘤疗效比较（n）

2.3 P-gp定性比较见表2。P-gp阳性界值计算：随机选择住院非恶性肿瘤患者20例，男性10例，女性10例，年龄40～73岁，中位年龄54.7岁，测得患者外周血淋巴细胞膜 P-gp含量为（1.47±0.26）%，计算 P-gp阳性界值为1.99%。外周血淋巴细胞膜P-gP含量大于1.99%，即定为阳性，小于1.99%即定为阴性。两组P-gp定性的比较，治疗组P-gp转阳率明显低于对照组（P＜0.05）。

表2 两组P-gp定性比较（n）

2.4 安全性分析治疗后两组患者化疗毒副反应如白细胞减少、恶心呕吐、腹泻以及肌酐（Cr）等方面相当（P>0.05）。

3 讨 论

具有活血化瘀功效的丹参主要用于治疗各种血瘀证、癥瘕积聚。研究表明，丹参酮ⅡA具有多种抗肿瘤侵袭和转移的作用。如敬静等［4］研究发现，100 ng/mL丹参酮ⅡA处理人ER阴性乳腺癌细胞72 h后，BCRP/ABCG2 mRNA表达降低，为对照组的0.44倍，提示丹参酮ⅡA通过下调BCRP/ABCG2基因表达可能具有逆转ER阴性乳腺癌细胞多耐药性的作用。以及本课题前期动物实验已证明了丹参酮ⅡA对小鼠S-180及Lewis肺癌多药耐药肿瘤有逆转多药耐药的作用，并发现其逆转耐药作用机制可能与降低P-gp、LRP、TopoⅡ表达有关［5，11］。 综合目前研究，笔者推测丹参酮ⅡA可能具有临床抗肿瘤作用。

本观察表明，丹参酮ⅡA注射液能够提高非小细胞肺癌的化疗疗效。这正好从临床方向验证了上述学者所指出的丹参酮ⅡA具有抗肿瘤的作用，能够提高化疗的疗效。至于临床上其抗肿瘤的机制，有待进一步的研究。笔者认为本实验的治疗后两组P-gp定性比较结果可能阐述了其中一种抗肿瘤机制。P-gp不仅出现在肿瘤细胞膜上，人外周血淋巴细胞 （如NK细胞、T细胞、B细胞等）如长期受某些药物的作用，其膜上的P-gP表达也会显著增加，这为临床上检测P-gp带来了方便［12］。笔者通过对32例患者治疗前后外周血P-pg定性的比较，发现使用丹参酮ⅡA组P-gp转阳率明显比未使用丹参酮ⅡA组的要低。由此，笔者推测，丹参酮ⅡA注射液可能是通过抑制P-gp的表达来发挥其抗肿瘤的作用。并且对32例患者的临床表现跟踪观察中，发现丹参酮ⅡA并不会增加化疗的毒副反应，说明其在临床使用是安全的。

抗药性是一个复杂的问题，涉及许多方面。临床上要克服耐药性，应首先确定该肿瘤的耐药机制，必要时应用多种逆转剂或治疗手段。本文结果表明丹参酮ⅡA能部分逆转非小细胞肺癌P-gp的表达，从而笔者大胆地推测丹参酮ⅡA或可成为治疗P-gp的表达阳性的多要耐药非小细胞肺癌的新选择，其作用及地位值得进一步深入研究。另本研究观察指标偏少，需更多时间、经费及相关检验仪器，从多方面来探讨丹参酮ⅡA抗肿瘤机制。

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