CD44干扰对人宫颈癌HeLa细胞体外转移的影响及其作用机制

庄俊雪，孙景生

(天津市宝坻区人民医院，天津301800)

CD44是一种广泛表达于多种细胞和组织的跨膜糖蛋白，可在多种肿瘤组织中表达［1，2］。CD44 有20个外显子，可以通过选择性剪切形成多种异构体，在多种组织和细胞中发挥不同的作用［3］。CD44包括胞外部分、跨膜部分和胞内部分，其中胞内部分既可以与细胞内其他信号分子结合参与细胞内的信号传导，也可以直接与细胞骨架蛋白相结合［4］。研究表明，CD44的胞内部分和细胞骨架蛋白的直接结合在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥重要作用，这可能与膜型基质金属蛋白酶1(MT1-MMP)的降解以及其他相关分子有关［5］。2011年7月～2012年7月，我们采用特异性shRNA对人宫颈癌HeLa细胞内CD44表达进行干扰，观察CD44表达降低对HeLa细胞体外转移能力的影响，并探讨其作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 人宫颈癌细胞株HeLa由本院实验室保存。RPMI 1640培养基及胎牛血清为Gibco公司产品;LipofectamineTM2000和Opti-MEM®I Medium购于Invitrogen公司;Transwell小室购于Millipore公司;Matrigel和 G418购于 BD公司;Real-time RTPCR试剂盒购自Transgen公司;MT1-MMP抗体及ECL显色液购自R＆D公司。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养 HeLa细胞复苏后，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，置37℃、5%CO2培养箱内。

1．2．2 细胞干扰试验 取HeLa细胞(1×105/孔)接种在24孔板中，待细胞生长至对数生长期，用无血清培养基清洗3遍，加入500μL无血清培养基。将0．8μg CD44 shRNA 和2μL的 LipofectamineTM2000分别与250μL的Opti-MEMk® I Medium混悬，轻轻混匀后静置5 min。将含有质粒DNA和LipofectamineTM2000的Opti-MEM®I Medium轻轻混匀后静置20 min。将混匀的Opti-MEM®I Medium均匀滴入含有无血清培养基的细胞中。5 h后用含有正常血清的培养基终止转染，24 h后加入终浓度为400μg/mL的G418筛选，2周后筛选结束进行试验。

1．2．3 细胞划痕试验 取一组转染空载体的HeLa细胞(对照组)和一组经过CD44 shRNA干扰后筛选出的HeLa细胞(观察组)(2×105/孔)接种在24孔板中，待细胞生长至融合后，用20μL枪尖垂直划痕，PBS洗去划掉的细胞，加入无血清培养基，培养箱内常规培养24 h，显微镜下拍照。以划痕损伤愈合的速度判断细胞迁移能力。

1．2．4 Transwell侵袭试验 用60μL Matrigel稀释液(1∶3)包被Transwell小室。取一组转染空载体的HeLa细胞和一组经过CD44 shRNA干扰后筛选出的HeLa细胞，用含0．1%BSA的 RPMI 1640培养基重悬细胞，上室加入200μL(5×104)细胞悬液，下室加入含20%FBS的RPMI 1640培养液500μL，每组重复3孔，培养箱内常规培养24 h。取出小室，用棉签擦去上室内的非侵袭细胞，倒置，风干，用0．1%结晶紫对小室背面侵袭的细胞进行染色，显微镜下拍照。

1．2．5 Real-time RT-PCR方法 Trizol法提取细胞总RNA，分光光度计测定总RNA浓度，取2μg RNA逆转录合成cDNA，按SYBR Green PCR试剂盒说明书加入各反应物，用ABI 7500系统进行扩增反应。反应条件为:95 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40个循环。以β-actin为内参照物，β-actin及MT1-MMP引物根据GenBank资料，利用Primer Premier 5．0软件设计，由上海生工生物公司合成。β-actin上游引物:5'-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3'，下 游 引物:5'-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3';MT1-MMP上游引物:5'-TGCCTGCGTCCATCAACA-3'，下游引物:5'-ATCTTGTCGGTAGGCAGC-3';CD44上游引物:5'-ACCCCAACTCCATCTGTGC-3'，下游引物:5'-TTCTGGACATAGCGGGTG-3'。

1．2．6 Western blot试验 收集观察组和对照组的HeLa细胞，裂解缓冲液提取细胞总蛋白，BCA定量试剂盒测定蛋白浓度，进行SDS-PAGE电泳，蛋白从凝胶电转至醋酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗(MT1-MMP 1∶200，β-actin 1∶500)4 ℃过夜。次日加二抗(MT1-MMP 1∶5 000，β-actin 1∶5 000)室温孵育1 h，ECL显影。以β-actin编码蛋白水平为内参。

1．2．7 统计学方法 采用GraphPad Prism软件进行统计分析，结果以¯x±s表示，组间比较采用t检验。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 shRNA干扰对HeLa细胞内CD44表达的影响

Real-time RT-PCR结果显示，CD44 shRNA干扰后，HeLa细胞内CD44的表达水平明显降低，CD44 mRNA和蛋白的表达水平分别下降40%和50%。见图1。

图1 shRNA干扰对HeLa细胞内CD44表达的影响

2．2 shRNA干扰对HeLa细胞迁移能力的影响细胞划痕试验显示，CD44 shRNA干扰后，HeLa细胞的迁移能力明显低于对照组。见图2。

图2 shRNA干扰对HeLa细胞迁移能力的影响(×100)

2．3 shRNA干扰对HeLa细胞侵袭能力的影响Transwell侵袭试验显示，观察组穿过小室滤膜的HeLa细胞数明显少于对照组，即观察组HeLa细胞的侵袭能力低于对照组。见图3。

图3 shRNA干扰对HeLa细胞侵袭能力的影响(×100)

2．4 shRNA干扰对HeLa细胞MT1-MMP mRNA和蛋白表达的影响 Real-time RT-PCR结果显示，与对照组相比，观察组HeLa细胞内MT1-MMP mRNA表达水平明显降低(P＜0．05)。Western blot结果显示，与对照组相比，经过CD44 shRNA干扰后，He-La细胞内MT1-MMP蛋白表达水平明显降低(P＜0．05)。见图4。

图4 shRNA干扰对HeLa细胞MT1-MMP mRNA和蛋白的影响

3 讨论

肿瘤转移是恶性肿瘤患者治疗失败和死亡的主要原因。肿瘤的迁移过程分为以下阶段:肿瘤细胞与肿瘤附近组织基底膜或细胞外基质的黏附，肿瘤细胞对基底膜和细胞外基质的局部降解，肿瘤细胞加强运动活力并通过血管向远处转移。因此，凡是影响肿瘤细胞与癌旁组织细胞的黏附、肿瘤细胞的运动活力以及调节细胞外基质降解的因素都可能参与肿瘤细胞的侵袭与转移［6］。

CD44是一种跨膜糖蛋白，在多种肿瘤细胞中呈高表达。CD44还是某些肿瘤干细胞的表面标志物。CD44最初作为黏附分子调节细胞与细胞或细胞与组织间的相互接触，但越来越多的研究表明，CD44的胞内部分可以与细胞内的其他信号分子相结合，调节肿瘤细胞的生长、凋亡、侵袭和转移。本实验结果表明，通过特异的shRNA干扰HeLa细胞内CD44的表达水平，可显著降低HeLa细胞的迁移和侵袭能力，从而抑制HeLa细胞转移。

基质金属蛋白酶(MMP)是依赖于锌离子的蛋白酶，其对细胞外基质和基底膜组分的降解以及一些非基质成分的作用改变了肿瘤细胞的微环境，促进了肿瘤的侵袭和转移［7］。MMP14/MT1-MMP是MT-MMP家族中首位被发现的成员，其可启动细胞表面多个蛋白级联反应。研究发现，MMP14与MMP2相互作用可通过多种机理改变肿瘤细胞生长的微环境，进而促进肿瘤的侵袭和转移［8］。本实验结果表明，抑制HeLa细胞内CD44表达，可显著降低MT1-MMP mRNA和蛋白的表达水平，这可能是导致HeLa细胞侵袭迁移能力降低的主要原因。

综上所述，HeLa细胞内CD44表达水平降低可显著抑制HeLa细胞的体外迁移和侵袭，从而抑制其转移能力，这种抑制效应可能与MT1-MMP表达降低相关。本研究为进一步了解宫颈癌转移的机制、提供临床治疗药物的作用靶点提供了理论依据。

［1］Bourguignon LY．CD44-mediated oncogenic signaling and cytoskeleton activation during mammary tumor progression［J］．J Mammary Gland Biol Neoplasia，2001，6(3):287-297．

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［3］PuréE，Cuff CA．A crucial role for CD44 in inflammation［J］．Trends Mol Med，2001，7(5):213-221．

［4］Isacke CM，Yarwood H．The hyaluronan receptor，CD44［J］．Int J Biochem Cell Biol，2002，34(7):718-721．

［5］Bourguignon LY，Gunja-Smith Z，Iida N，et al．CD44v(3，8-10)is involved in cytoskeleton-mediated tumor cell migration and matrix metalloproteinase(MMP-9)association in metastatic breast cancer cells［J］．JCell Physiol，1998，176(1):206-215．

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［7］江州华，俞继卫，姜波健．基质金属蛋白酶对胃癌微环境调控作用的研究进展［J］．中国普外基础与临床杂志，2009，16(9):768-772．

［8］Koyama S．Enhanced cell surface expression of matrix metal-loproteinases and their inhibitors and tumor-induced host response in progression of human gastric cancer［J］．Dig Dis Sei，2004，49(10):1621-1630．