HPV 感染与P53 在食道癌患者中的表达意义及临床观察

王斌

(天津市第四中心医院胸心血管外科，天津 300140)

食道癌(esophageal cancer)，是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤［1］，我国是食道癌高发国家，也是食道癌死亡率最高的国家［2］。其发病因素目前还不明确，研究表明，食道癌发生与环境、饮食、遗传、不良生活习惯、遗传等因素关系密切，是多种因素同时作用的结果［3］。随着病毒学和分子生物学技术的发展，病毒性感染与食道癌的疾病相关性越来越受到广大医生的重视［4］。目前，关于HPV 和P53 与食道癌的疾病相关性的研究较少［5］。本研究应用免疫组化(ELISA)方法，对食道癌组织和食道良性肿瘤组织及正常食道组织中的HPV 和P53 进行检测，并对其与食道癌的疾病相关性进行了探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2008 年11 月至2012 年12 月本院胸外科住院食管癌手术患者的食管组织85 例，其中食管癌组织45 例，食管良性肿瘤组织20 例，正常食管组织(取自良性肿瘤瘤旁组织2 cm 以上)20 例。每例均有完整的临床资料，男49例、女36 例。食管癌组平均年龄(60 ±1)岁(40～77)岁，参照国际食管癌原发肿瘤分级标准:早期患者11 例，进展期患者25 例，晚期患者9 例;无淋巴结转移患者16例，有1 处淋巴结转移患者15 例，有2 处腋淋巴结转移患者10 例，有3 处腋淋巴结转移患者4 例。所有病例均术前快速冷冻病理和术后常规病理检查确诊，标本获取后常规固定在10%福尔马林液体中，然后用石蜡包埋。术前均未化疗、放疗及免疫治疗。两组患者年龄、性别、患病程度等无显著性差异(P ＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 试剂及仪器 鼠抗人HPV 单克隆抗体、P53 试剂盒均由(上海研域生物科技有限公司);增敏二氨基联苯胺(DAB)显色液、免疫组化染色试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司;台式离心机(LD4－2A 型 北京京立离心机有限公司);恒温水浴锅(北京东方精瑞科技公司);超净工作台(天津市泰斯特仪器有限公司);光学显微镜(上海光学仪器厂);AS325 轮转式石蜡切片机(英国SHANDON公司);病理组织漂烘处理仪(PHY－Ⅲ，常州);IMAGEPLUS 6.0 图象分析系统(日本MOTIC 公司)。

1.2.2 方法 每例标本同时取材2 块，一块中性福尔马林固定，石蜡包埋用于免疫组化、病理确诊、组织分型等;一块备用。组织切片依次置于二甲苯浸泡，加新配制的3%H2O2于组织切片上，室温孵育10 min 后微波炉中加热，用PBS 洗2 min;加正常山羊血清工作液(蓝色液体)封闭，室温孵育15 min，倾去勿洗;将HPV、P53 试剂充分混匀，不要使液体产生大量的泡沫，以免产生加样上的误差。根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔做复孔。每个样品根据实验的数量来定。HPV、P53 用标本稀释液1∶1 稀释后加入50 μL 于反应孔内。加入稀释好后的标准品50 μL 于反应孔、加入待测样品50 μL 于反应孔内。立即加入50 μL 的生物素标记的抗体，轻轻振荡混匀，37 ℃温育1 h。甩去孔内液体，振荡30 s，用吸水纸拍干，重复3 次。每孔加入80 μL 的亲和链酶素－HRP，轻轻振荡混匀，37 ℃温育30 min。甩去孔内液体，振荡30 s，用吸水纸拍干，重复3 次。每孔加入底物A、B 各50 μL，轻轻振荡混匀，37 ℃温育10 min，避免光照。取出酶标板，迅速加入50 μL 终止液，加入终止液后应立即测定结果，在450 nm 波长处测定各孔的OD 值，在两个检测标准品的OD 值减去空白孔的OD 值后取其平均值计算。应用curve 专业软件算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。HPV ＞100 U/L、P53 ＞80 ng/mL 即为异常。

1.3 统计学方法

采用SPSS11.5 统计软件，两组间指标的比较采用t 检验，多组间的比较采用方差分析及q 检验。

2 结 果

2.1 HPV、P53 在食管癌中表达为(290 ±20)U/L、(189±15)ng/mL，均较其它两组为高，正常组织中几乎无表达，见表1。

表1 HPV、P53 在食管癌、良性瘤和正常组织中的表达水平()

2.2 HPV16/18 的表达与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系为随着TMN 分期的升高，HPV、P53的表达率明显增加，见表2。

表2 HPV16/18 的表达与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系()

3 讨 论

人乳头瘤病毒 (HPV)于1933 年被人类首次发现，HPV 是一类主要于鳞状上皮层寄生的小分子DNA 肿瘤病毒，无包膜，不含脂质，HPV 是感染人体组织中分布最广的肿瘤病毒之一［6］。HPV 感染人体的主要靶细胞是有增生能力的表皮或者粘膜上皮细胞，即基底层细胞［7］。在这层细胞之上常覆有几层不能增生分裂的已分化成熟的细胞层，即只有物理保护屏障受损时，病毒才能进入基底层细胞。学者们认为基底层细胞整合素(Integrin)可能是HPV 的病毒受体介导HPV 进入基底细胞，进行病毒复制和调控细胞恶性转化的主要原因。基底层细胞整合素还可以改变控制细胞周期的途径，尤其与抑癌蛋白P53 和Rb 的结合可使正常细胞丧失细胞周期调控能力，导致细胞周期失控而发生永生化［8］。P53 是一种抑癌基因(tumor suppressor gene)，在所有恶性肿瘤中，都会出现该基因的突变，这种基因控制着细胞周期的启动，许多有关细胞健康的信号向P53 蛋白发送［9］。细胞中抑制癌变的基因“P53”会判断DNA 变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复，若DNA 变异较大，P53 就诱导细胞凋亡。P53 是重要的肿瘤抑制基因，说明该基因的改变很可能是人类肿瘤产生的主要发病因素［10］。本研究显示三组患者乳腺组织中HPV、P53 表达水平比较(t=5.33、5.44、5.78，P ＜0.05，具有显著性差异)。有淋巴结转移者的表达率明显高于无淋巴结转移癌者(t=5.66，5.65、5.77，P ＜0.05，具有显著性差异);随着TMN 分期的升高，HPV、P53 的表达率明显增加(t=5.46、5.67，P ＜0.05，具有显著性差异)。以此推论，一旦发生HPV 感染，P53 基因发生突变，使P53 蛋白失活，细胞分裂失去节制，就可发生癌变，另外HPV 与P53 基因组整合的作用也可能是引起HPV 致癌的另一个重要途径，随着病理分期增高表达而增高，HPV 在人体内有很长的潜伏期，一般感染二、三十年后才致癌，可能与病毒整合到宿主基因适当的位置耗时较长有关［11］。

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