bFGF 对在大鼠系膜细胞和抗Thy－1肾炎SDH 表达的影响

岳凌菊

(北京市通州区潞河医院肾病内科，北京 101149)

以往的研究发现，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)可以调节肾脏系膜细胞(mesangial cell，MsC)生长并促进细胞外基质(extracellul matrix，ECM)的代谢，能引起肾小球炎症、肾脏纤维化和硬化病变［1］。多项研究报道表明，山梨醇脱氢酶(sorbitol dehydrogenase，SDH)为多元醇通路(polyol pathway)中的一个酶，参与肾小球炎症、肾脏纤维化和硬化的发生、发展，特别是在糖尿病肾病的发病过程中发挥重要作用［2］。为此，本实验采用体外施加外源性bFGF 对培养的大鼠MsC 中SDH 表达的影响，并同时应用抗血清制作大鼠抗Thy－1 肾炎模型［3］，应用这个动物模型在体探讨bFGF、SDH 的表达以及二者之间的相互关系，为深入探索bFGF 和SDH在肾小球硬化发生机制中的作用及其相互关系提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 大鼠系膜细胞(MsC)培养

实验动物为150～180 g SD 大鼠(SPF 级，购自中科院)，取肾皮质，分离肾小球，按实验室常规方法在无菌条件下分离培养与鉴定MsC。MsC 生长至亚汇合状态后，用0.25% 胰蛋白酶 (含0.01EDTA)消化并传代，将其(1 ×106)接种于6 cm 培养皿中，继续传代培养。实验选用传6～9代的细胞。

1.2 MsC 的处理

待MSC 生长至80%汇合时，应用饥饿法处理细胞24 h，即完全培养基更换为RPMI1640 (含0.5% FBS)培养液，然后向0.05%FBS 的RPM 1640 培养基中加入人重组bFGF 处理，使其终浓度达到2 ng/mL，选择0、12、24 h，收集细胞提取总蛋白和总RNA。另一组向培养基中加入人重组bFGF 处理，使其终浓度达到0、2、5 ng/mL，处理24 h 后，收集细胞并提取总蛋白和总RNA。

1.3 大鼠抗Thy－1 模型制作

选择雄性SD 大鼠(SPF 级，150～200 g，购自中科院)36 只，实验分组情况如下:对照组(N 组，n=6)、肾炎组(G 组，于尾静脉注射兔抗鼠Thy1 血清，分别于注射后1、3、5、7、14 天处死动物，其中14 d 组在第7 天加强1 次，每个时间点各6 只动物)［3］241－243。动物处死后，分离肾皮质并提取总蛋白备用。

1.4 Western blot 检测bFGF、SDH 蛋白

取1.2、1.3 方法中提取的总蛋白各20 mg，按照试剂盒说明应用Western blot 方法检测bFGF、SDH 的蛋白检测。一抗为小鼠抗人SDH 单克隆抗体(1 ∶500，Santa Cruz 公司)和兔抗人bFGF 多克隆抗体(1 ∶200，Santa Cruz 公司)。

1.5 RT－qPCR 检测SDH mRNA

分别取MsC bFGF 刺激后不同时间段、不同浓度bFGF 刺激后的总RNA 2 mg 逆转录为cDNA。等量cDNA 进行 qPCR 反应，引物如下:SDH(sense:TTAGAGGAGCTGGCGTGCCTTAAA;antisense TGCTTCGTCT CCTCACCCAAAGAA);GAPDH (sense: CCACAG TCCATGCCATCAC; antisense:CCACCACCCTGTTG CTGTAG)。采用ABI公司7900 实时定量PCR 仪进行qPCR 试验，采用Sybergreen 染料掺入法，并计算相对浓度。

2 结 果

2.1 MsC 的培养

肾小球在原代培养的72 h 后开始贴壁，在96 h 左右开始有细胞从肾小球的周围爬出，1 w 时可见爬出的细胞明显增多。最初的细胞呈长圆形，偶可见有突起的细胞，后逐渐呈长梭形，类似成纤维细胞，偶可见细胞呈类神经元的形态。2 w 时，可见细胞达到85%左右的融合。常规传代培养后，其生长状态与间充质干细胞的状态相似，12 h 开始贴壁，并且细胞生长迅速，大约在5 d 左右细胞可以进行下一次传代。

2.2 bFGF 作用后大鼠系膜细胞SDH mRNA 的表达

SDH mRNA 在2 ng/mL bFGF 刺激后，其表达开始升高，在24 h 达到高峰;同样，在不同浓度bFGF 作用后，SDH mRNA 也表达升高，在5 ng/mL 达到高峰(图1)，显示了时间剂量依赖性。

2.3 bFGF 作用后大鼠系膜细胞SDH 蛋白的表达

SDH 蛋白在bFGF 作用后表达升高，在24 h达到高峰;同样，在不同浓度bFGF 作用后，SDH蛋白也表达升高，在5 ng/mL 达到高峰，其趋势与核酸水平的变化吻合(图2)，同样显示了时间剂量依赖性。

2.4 ATG 大鼠肾皮质bFGF、SDH 的表达

Western blot 检测结果发现，在制作大鼠抗Thy－1 模型实验过程中，bFGF 表达量从注射后第3天起开始逐渐升高，到第7 小时达到高峰，一直维持在此水平，直到第14 天。SDH mRNA 的表达从实验第3 天起开始持续升高，至14 d 达到高峰(图3)。

3 讨 论

大量研究表明，细胞外基质异常沉积是肾小球硬化发生和发生的重要病理过程之一，肾小球内功能活跃的固有细胞—系膜细胞和bFGF 在这一过程中起着重要作用，但其确切作用机制的研究尚有待完全阐明。SDH 是多元醇代谢通路中的一个酶，其作用是可逆地催化D－山梨醇氧化为D－果糖。目前对SDH 的研究不多，但SDH 在糖尿病肾病中发挥重要作用。其催化功能可以改变肾脏微环境之内的活性氧自由基(ROS)生成，促进糖尿病肾病的发展［4］。但SDH 在非糖尿病肾病的中的作用鲜见报道。bFGF 为体内修复过程中的重要生长因子，可以调控大量细胞外基质的合成、代谢，特别在促进细胞增殖分裂过程中，发挥重要作用［5］。但是，bFGF 对于SDH 是否具有调控作用，目前未见报道。

本实验通过在大鼠MSC 培养过程中，向培养基中添加bFGF 后检测SDH 的表达，并在抗Thy－1 模型的基础上在体检测了bFGF 对SDH 表达的影响。本实验结果表明，外源施加bFGF 因子可以使大鼠肾脏系膜细胞SDH 的表达量升高，并且SDH升高的程度随着作用时间延长和浓度增高而表达增强，呈现出时间、剂量依赖性。在ATG 动物模型中，随着病程的延长，bFGF 和SDH 皆表达增高。这表明，bFGF 可以在体内、体外上调SDH 的表达，这种上调可能使得SDH 参与了非糖尿病性的肾炎、肾纤维化和硬化过程，但其中的具体机制还有待进一步研究。

图1 外源性bFGF 作用MsC 不同时间、不同浓度bFGF 作用MsC 24 h 后SDH mRNA 的表达

图2 外源性bFGF 作用MsC 不同时间、不同浓度bFGF 作用MsC 24 h 后SDH 蛋白的表达

图3 ATG 大鼠不同时段肾皮质bFGF、SDH 蛋白的表达

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