Hedgehog 信号通路中Smo 蛋白在食管鳞癌中的表达及意义

金昊，谷景先，臧东钰

(1.辽宁医学院附属第三医院，辽宁 锦州121001;2.辽宁省辽河油田总医院，辽宁 盘锦 124000;3.辽宁省锦州军分区后勤部，辽宁 锦州 121001)

食管癌的发生、发展涉及多种基因及不同信号传导通路的异常变化。近年来研究发现，一个与胚胎发育密切相关的信号传导通路－Hedgehog (Hh)信号通路，在癌症的发生、发展中也起着重要作用［1］。本实验应用免疫组织化学技术观察Smo 蛋白的表达，探讨Hh 信号通路中的膜蛋白受体Smo异常激活与食管鳞癌之间的关系，为研究Hh 信号通路对食管鳞癌影响的机制提供一些理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂 50 例食管鳞癌及癌旁组织标本取自辽宁医学院附属第三医院和附属第一医院2010—2012 年手术切除标本。患者均为男性，年龄49～75 岁。Smo 兔多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司，SABC 试剂盒购自武汉博士德生物制品有限公司。

1.2 免疫组织化学染色 石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2孵育，蒸馏水冲洗，PBS 浸泡。高压修复后自然冷却，10% 正常山羊血清(PBS 稀释)封闭。滴加一抗工作液(1 ∶50)，4 ℃过夜，PBS 冲洗。滴加生物素化山羊抗兔IgG/兔抗羊IgG，湿盒内37℃孵育，PBS 冲洗。滴加SABC 试剂，湿盒内37℃孵育。PBS 冲洗，DAB 显色，核复染。自来水冲洗，脱水，透明，封片。

用已知的阳性对照片做阳性对照，以PBS 代替一抗作阴性对照。光学显微镜下观察并摄片。

1.3 结果判定 由两位病理医师分别对染色结果作出判定。以胞质或胞膜出现浅黄色至棕黄色颗粒判断为阳性，以染色强度结合阳性细胞百分比综合计分作定性分析［2］。随机选取10 个高倍视野，分别计数200 个细胞。 (1)按阳性细胞占细胞总数的比例分级:0～5%、5～25%、25～50%、 ＞50% 对应0、1、2、3 分。(2)根据阳性细胞的着色强弱分级:阴性、浅黄色、棕色、深棕色对应0、1、2、3 分。两项评分结果相加进行结果判断，0 分、1～2 分、3～4 分、5～6 分分别对应－ (阴性)、+ (弱阳性)、 + + (中度阳性)和+ + +(强阳性)。+ + / + + +为异常表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0 统计软件进行统计分析，计数资料采用卡方检验。

2 结 果

2.1 免疫组织化学结果 Smo 蛋白主要表达在胞膜和胞质。Smo 在癌旁组织中不表达，但在鳞癌中呈高表达，二者比较有显著性差异(P ＜0.05，图1)。

2.2 Smo 在ESC 中的表达与临床病例特征的关系Smo 在ESC 中的表达与患者的年龄、病变部位均无关(P ＞0.05)，但与与肿瘤分化程度、淋巴结转移密切相关(表1)。

表1 50例患者Smo 蛋白在食管鳞癌中的表达与临床病例特征的关系

3 讨 论

食管癌的发生、发展与其它恶性肿瘤一样，都会出现细胞内多种基因的表达改变［3］，而这些改变最终会引起相关蛋白的表达水平发生变化。因此，寻找食管癌特异性的基因及其蛋白产物的变化，对于食管癌的诊断和治疗具有重要意义。近年来，与胚胎发育密切相关的Hh 信号传导通路逐渐进入了肿瘤研究领域，并日益受到学者的关注。研究发现，在前列腺癌、胃癌、基底细胞癌、胰腺癌等的发生、发展过程中，都存在Hh 信号通路的异常激活［1，4－7］12。

哺乳动物的Hh 信号通路主要由Hh 配体、膜蛋白受体(包括Ptch 和Smo)及其下游的核转录因子和目的基因组成。一般认为缺乏Hh 配体时，Ptch与Smo 组成受体复合物并抑制Smo 活性;而当Hh大量存在时将与Ptch 结合，解除了Ptch 对Smo 的抑制作用，Smo 被激活并将信号下传，导致转录因子Gli 被激活并进入细胞核，启动下游目的基因的表达［8］。本实验结果发现，Smo 蛋白主要表达在胞膜和胞质，这与其膜蛋白受体的身份相符。本实验在癌旁组织中未能检测到Smo 蛋白的表达，但在食管鳞癌中Smo 蛋白则呈高表达，且其表达与食管鳞癌的分化程度和淋巴结转移密切相关。推测Smo 蛋白可能参与了食管鳞癌的发生和发展过程。

Kiselyov、Lauth 等［9－10］分别利用针对Smo 蛋白的特异性小分子抑制剂环靶明进行体外实验，发现在抑制Smo 蛋白的活性后，多种肿瘤细胞的生长都受到了明显的抑制。但是，Smo 如何被激活的以及Smo 究竟怎样通过Gli 基因家族发挥作用等尚不明了。因此，进一步深入了解Hh 信号传导通路的作用机制及其与食管癌发生、发展的关系，将有可能为食管癌诊断和治疗提供理想的分子靶标。

图1 Smo 在食管鳞癌中的表达 ×400

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