树突状细胞在抗白色念珠菌感染中的作用

陈 华，蒋李懿，乔鸣芳，资云玲，李风舟

（广东省口腔医院黏膜科，广州 510280）

念珠菌是广泛存在于人和动物体内的条件致病菌，其中引起人类念珠菌疾病的主要是白色念珠菌，又称白色假丝酵母菌（candida albicans，CD）。 正常人CD 的带菌率以口腔为最高。近年来，随着各种抗肿瘤化疗药物、免疫抑制剂、皮质激素和广谱抗生素在临床上的广泛应用，以及器官移植、介入治疗的不断实施，口腔CD 感染的发病率呈不断上升趋势［1-2］。 T 细胞免疫在抗CD 感染的过程中起着非常重要的作用, Th1 /Th2 比例的失调，有利于CD 病的发展。 IL-12 是连接天然免疫和获得性免疫的一个重要纽带，又是促进CD4+T 细胞向Th1 细胞分化的重要细胞因子。 树突状细胞 （dendritic cell,DCs）可产生IL-12，是目前已知的功能最强的抗原呈递细胞，也是机体免疫反应的始动者［3］。 在系统性真菌感染中，Th1 类因子介导的细胞免疫对机体起了保护作用，故测定抗原提呈细胞识别捕捉抗原后分泌IL-12 水平的高低是判断免疫应答方向的有效指标［4］。本研究观察了DCs 受CD 抗原冲击后分泌IL-12 的变化，初步探讨DCs 在抗CD 感染中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8 周龄SPF 级C57BL/6 小鼠4 只，雌雄不拘，体质量18～20 g，购自湖南省斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证编号：HNASLKJ20101432，清洁环境饲养。

1.2 主要试剂与药物

沙保琼脂培养基（sabourd’s dextrose agar，SDA，广州迪景微生物科技公司），胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）及RPMI-1640 培养基（北京索莱宝科技有限公司），青霉素、链霉素溶液和红细胞裂解液（上海玉博生物科技有限公司），重组小鼠细胞因子GM-CSF（rGM-CSF）和重组小鼠细胞因子IL-4（rIL-4，美国R&D 公司），小鼠IL-12 ELISA 试剂盒（上海抚生实业有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 小鼠骨髓DCs 的制备与培养

参照文献［5-6］的方法，制备与培养小鼠骨髓DCs，其具体步骤：1）将C57BL/6 小鼠断颈处死，浸泡于碘伏液中消毒5 min；2） 无菌条件下取后肢双侧股骨、胫骨，浸泡于500 U·mL-1双抗（青霉素和链霉素）PBS 中，剔净周围组织，洗净后离断干骺端，用注射器针头破坏骨小梁后，用无血清1640 反复抽吸、冲洗髓腔，收集骨髓细胞悬液；3）将所得细胞悬液过200 目钢网，吹打成单细胞悬液；4）将单细胞悬液离心、弃上清，加0.5 mL 红细胞裂解液重悬，于室温下静置5 min，加无血清1640 稀释，离心、洗涤2 遍；5） 用DC 诱导体系 ［RPMI-1640+10%FBS+rGM-CSF（20 ng·mL-1）+rIL-4（20 ng·mL-1）］定容制成细胞悬液，调至细胞浓度为1×107mL-1，置24 孔培养板中，每孔1 mL；置37 ℃、5%CO2培养箱中培养；6）3 d 后，吸弃悬浮细胞，加入同体系培养液，1 mL·孔-1，显微镜下可见细胞长出树突样突起，继续培养，隔天半量换液。

1.3.2 CD 菌株和鉴定

从广东省口腔医院黏膜牙周科确诊的20 例口腔念珠菌病患者的唾液中分离出CD 菌株，SDA 培养，经念珠菌CHROM agar 鉴定，45 ℃生长实验，玉米吐温80 培养基培养和念珠菌API 20C AUX 鉴定保种。

1.3.3 CD 菌株扩增

CD 菌株用SDA 28 ℃培养48 h， 菌液浓度调至5×105mL-1，转种于YPD 液体培养基，调至5×105mL-1，置摇床150 r·min-1、25 ℃振荡培养48 h，离心弃上清，将菌液浓度调至1×108mL-1，加入含FBS 的RPMI-1640 培养基，菌液浓度调至为5×105mL-1，置37 ℃水浴箱培养3 h，得到即为菌丝相CD。

1.3.4 CD 对DCs 的冲击实验及分组

待上述DCs 培养6～7 d，收取漂浮的DCs,调至细胞浓度为2×106mL-1， 以2 倍于DCs 的细胞数加入CD，每孔1 mL 置6 孔培养，共同置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育。 分2组进行实验：DCs+CD 组和DCs 组。 DCs+CD 组每孔中加入CD，使其终浓度为1×107mL-1，DCs 与CD 的比例为1∶10；置37 ℃、5% CO2孵箱中培养4、12 及24 h 后分别取出培养孔的培养液, 2 000 r·min-1离心2 min 后，取上清液。 DCs 组不加CD，DCs 细胞培养4、12 及24 h 后分别取出培养孔的培养液，2 000 r·min-1离心2 min后， 取上清液。 均采用ELISA 法检测上清液中细胞因子IL-12。

1.4 统计学方法

2 结果

DCs 组的DCs 有少量的IL-12 分泌，随着时间的推移，有缓慢增多的趋势。 培养到4 h 时，2组的IL-12 浓度比较差异无统计学意义（t=0.42，P＞0.05）。培养12、24 h 时，DCs+CD 组分泌的IL-12 浓度分别为（150.12±56.38）和（1 236.24±125.33）ng·L-1，显著高于DCs 组的（93.65±29.18）和（347.56±76.54）ng·L-1（t=3.978，t=32.837，均P＜0.05）。 见表1。

表1 2组各时间段DCs 分泌IL-12浓度的比较 ，ρ/（ng·L-1）

3 讨论

口腔念珠菌病是人类最常见的口腔真菌感染，引起口腔念珠菌病最常见的是CD［1］。 CD 具有亚硝基化潜力，在口腔黏膜白斑向口腔癌转变的过程中起到了促进作用［7］。 因此，对CD 感染的研究越来越多。

DCs 是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，是机体免疫应答的始动者，在免疫反应中起着关键的作用。正常情况下，体内绝大多数DC 处于未成熟状态，这时它具有较强的抗原呈递能力。 目前从多种组织中已能分离诱导出具有正常功能的DC，而不同来源以及处于不同发育阶段DC 具有不同的生物学特征［8］。 1992 年，Reid 等［9］在骨髓细胞中鉴定出DCs 的造血干细胞克隆，并且在GM-CSF 和TNF-α 的共培养下它能分化成DCs 及巨噬细胞。由于骨髓来源方便，且DCs 前体细胞的含量亦相对较多，因此在随后的研究中成为应用较多的DCs 来源［6］。 本实验采取小鼠骨髓体外培养、细胞因子rGM-CSF 和rIL-4 细胞因子联合诱导培育的方法，以IL-4 阻止巨噬细胞发育生长，从而获得了大量高纯度的DCs。

DC 可分泌IL-12、NO 及IFN-C 等，调节CD4+Th细胞向Th1 型分化。 Th1 型细胞主要介导细胞免疫应答, 可以增强吞噬细胞功能, 增加机体对CD 的抵抗力。IL-12 是特异性细胞免疫应答中的基本介质，也是测定CD 免疫的核心指标［10］。 本实验观察到体外培养的小鼠骨髓DCs 能分泌IL-12，但受CD 抗原冲击后，DCs 分泌的IL-12 明显高于单纯DCs组，且随着时间的推移，IL-12 分泌量逐渐增加。表明DC 在成熟过程中可以分泌IL-12，但DCs 被CD活化后IL-12 的分泌量增大。笔者推测，分泌增多的IL-12 对DC 功能的发挥可能起着至关重要的作用，在Th1 /Th2 之间的平衡调控机体免疫状态过程中，促使Th0 分化为Th1 型细胞增多，使宿主产生对CD 的抵抗，这也可能是CD 致敏的DCs 能高效地诱导抗CD 免疫的原因之一。

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